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Jul 10, 2023

Entwicklung einer Döbelmakrele mit weniger

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 3190 (2023) Diesen Artikel zitieren 859 Zugriffe 1 Zitate 10 Details zu altmetrischen Metriken Genombearbeitung ist eine Technologie, die die Ernte und Ernte erheblich beschleunigen kann

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3190 (2023) Diesen Artikel zitieren

859 Zugriffe

1 Zitate

10 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Genomeditierung ist eine Technologie, die die Pflanzen- und Tierzucht durch künstliche Induktion gewünschter Merkmale mit hoher Genauigkeit erheblich beschleunigen kann. Ziel dieser Studie war die Entwicklung einer Döbelmakrelensorte mit reduzierter Aggression mithilfe eines experimentellen Systems, das eine effiziente Eisammlung und Genombearbeitung ermöglicht. Die sexuelle Reifung und die Kontrolle der Laichsaison und -zeit wurden technologisch durch die Kontrolle der Photoperiode und der Wassertemperatur des Aufzuchtbeckens erleichtert. Darüber hinaus wurden geeignete Niedertemperaturbehandlungsbedingungen zur Verzögerung der Spaltung, die Form der Glaskapillare und die Injektionsstelle im Detail untersucht, um ein effizientes und robustes Mikroinjektionssystem für die Studie zu entwickeln. Ein Arginin-Vasotocin-Rezeptor-V1a2 (V1a2) Knockout (KO)-Stamm der Döbelmakrele wurde entwickelt, um die Häufigkeit kannibalischen Verhaltens im Brutstadium zu reduzieren. Die Videodatenanalyse mittels Biobildinformatik quantifizierte die Häufigkeit aggressiven Verhaltens und zeigte eine signifikante Reduzierung der Häufigkeit kannibalischen Verhaltens um 46 % (P = 0,0229) im Vergleich zum Wildtyp. Darüber hinaus verringerte sich beim V1a2-KO-Stamm auch die Häufigkeit von Kollisionen mit der Wand und der Sauerstoffverbrauch. Insgesamt kann der hier beschriebene beherrschbare und ruhige Phänotyp möglicherweise zur Entwicklung eines stabilen und nachhaltigen Meeresprodukts beitragen.

Die Weltbevölkerung hat bereits die Grenze von 7 Milliarden überschritten und wird bis 2050 schätzungsweise 9,8 Milliarden erreichen1. Aufgrund dieses schnellen Bevölkerungswachstums ist der Pro-Kopf-Verbrauch an tierischem Eiweiß weltweit gestiegen. Bis 2030 kann das Proteinangebot möglicherweise nicht mehr mit der Nachfrage Schritt halten, was zu einer Lebensmittel-„Proteinkrise“ führen wird. Insbesondere bei Produkten aus der Aquakultur herrscht aufgrund des Wirtschaftswachstums in Schwellenländern und der rasant steigenden Nachfrage der gesundheitsbewussten Bevölkerung in Europa und den USA nach Fisch und Schalentieren weltweit ein vorherrschender Erwerbswettbewerb. Unter diesen Umständen ist die weltweite Fangfischereiproduktion seit den 1990er Jahren unverändert bei etwa 90 Millionen Tonnen geblieben und hat fast ihre Grenze erreicht2. Die Aquakulturproduktion nimmt jedoch immer noch zu, und im Jahr 2014 überstieg die Produktion von Speisefischen und Schalentieren die Fänge aus natürlichen Quellen2. Daher wird erwartet, dass die Aquakulturindustrie als wachsende Industrie in der Proteinversorgung weiterhin dramatisch expandieren und erheblich zur nachhaltigen Nahrungsmittelversorgung der Welt beitragen wird. Für die weitere Entwicklung der Aquakulturindustrie wäre es notwendig, Fische zu züchten, sie genetisch zu verbessern und Sorten mit Eigenschaften zu produzieren, die für die Aquakulturproduktion geeignet sind und dem Verbrauchergeschmack entsprechen.

Für die Zucht von Speisefischen wurden durch selektive Züchtung schnell wachsende Stämme der Roten Meerbrasse (Pagrus major) entwickelt3. Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)4 und Olivenflunder (Paralichthys olivaceus)5 mit krankheitsresistenten Eigenschaften wurden durch selektive Züchtung unter Verwendung genetischer Marker entwickelt. Die Produktion neuer Rassen erfordert jedoch einen enormen Zeitaufwand, eine für eine bestimmte Fischart spezifische Zuchtanlage sowie viel Arbeit und Geld; Daher hat sich die Zucht von Fischen im Vergleich zu der von Nutztieren erheblich verzögert. Die Genome-Editing-Technologie, die kürzlich in praktische Anwendungen eingeführt wurde, hat weltweite Aufmerksamkeit auf sich gezogen, da sie in der Lage ist, das gewünschte Merkmal mit hoher Genauigkeit künstlich hervorzurufen und die Zucht erheblich zu beschleunigen. Genomeditierung wurde bereits bei der Zucht von Speisefischen wie Karpfen (Cyprinus carpio)6, Kanalwels (Ictalurus punctatus)7 und Roter Meerbrasse8 angewendet, wobei durch die Bearbeitung des Myostatin-Gens, das die Muskulatur reguliert, die Muskelmasse zunimmt Entwicklung.

Die Döbelmakrele (Scomber japonicus) ist ein Meeresfisch der Ordnung Perciformes, der in gemäßigten und subtropischen Regionen der Welt vorkommt und eine wichtige Fischart in Japan ist. In den letzten Jahren wurde in verschiedenen Gebieten Japans mit der Aquakultur dieser Art begonnen, um eine stabile Versorgung zu gewährleisten, die nicht durch den Fang aus der Natur beeinträchtigt wird; 2012 hatten wir zum ersten Mal ein Aquakultursystem mit vollständigem Lebenszyklus eingerichtet. Die Döbelmakrele ist nicht nur eine vielversprechende Art für die Aquakultur, sondern gehört auch zur Ordnung Scombridae, zu der viele wichtige Fischarten gehören, wie zum Beispiel der Blauflossenthun (Thunnus orientalis). , Gelbflossenthun (Thunnus albacares) und Japanische Spanische Makrele (Scomberomorus niphonius); Daher könnten die Erkenntnisse aus der Forschung zu dieser Art letztendlich auf viele Arten anwendbar sein. Darüber hinaus weist es nützliche Eigenschaften auf, um eine Modellart für Meereszuchtfische zu sein, wie z. B. die Reifung innerhalb eines Jahres, im Gegensatz zu anderen Meeresfischarten, deren Reifung mehrere Jahre dauert. Ein Problem bei der Aquakultur von Döbelmakrelen über den gesamten Lebenszyklus hinweg ist jedoch die geringe Überlebensrate der Jungfische. Es ist bekannt, dass Scombridae-Fische, darunter Roter Thunfisch, aggressives Verhalten und sogar Kannibalismus im Brutstadium zeigen9, und bei Döbelmakrelen ist die Produktionseffizienz aufgrund des kannibalischen Verhaltens der Jungfische deutlich niedrig. Döbelmakrelenbrut wird etwa 14 Tage nach dem Schlüpfen stark kannibalisch, und mit üblichen Zuchttechniken überleben nur etwa 10 % unmittelbar nach dem Schlüpfen, bis sie eine Körperlänge von etwa 10 cm erreichen. Wenn die Überlebensrate durch die Unterdrückung des Kannibalismus verbessert werden kann, wäre dies ein großer Vorteil für die Produzenten und würde so zur Verbesserung der Produktivität und zur Verwirklichung eines nachhaltigen Aquakultursystems beitragen.

Die Neuropeptide Arginin-Vasotocin (AVT) und Arginin-Vasopressin sind Schlüsselmodulatoren der Zugehörigkeit bzw. Aggression bei Nicht-Säugetier- und Säugetier-Wirbeltieren10. Beispielsweise neigen tropische Riffbarsche (Stegastes leucostictus) dazu, in der AVT-injizierten Gruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe eine deutlich höhere Aggressivität gegenüber Eindringlingen in das Revier zu zeigen11. Ebenso wurde berichtet, dass die Verabreichung von AVT das aggressive Verhalten bei Schlammspringern (Periophthalmus bescheidenus) verstärkt12. Knochenfische verfügen über vier AVT-Rezeptoren (V1a1, V1a2, V2a und V2b)13. In einer Studie an Blaukopf-Lippfischen (Thalassoma bifasciatum) wurde berichtet, dass die Verabreichung eines V1a-Rezeptor-Antagonisten die Aggression deutlich reduzierte14. Insbesondere haben neuere Studien mit Genom-Editierungstechnologie berichtet, dass das Partnerschutzverhalten, einschließlich Aggression, bei Medaka (Oryzias latipes) mit ausgeschalteten V1a2-Rezeptoren deutlich reduziert ist15.

Ziel der aktuellen Studie war die Entwicklung einer einfach zu züchtenden, handhabbaren Döbelmakrelensorte mit reduziertem kannibalischem Verhalten während der Brutzeit mithilfe von Genom-Editing-Technologie. Um die Bearbeitung des Genoms und eine effiziente Eizellentnahme durchzuführen, müsste ein System mit hoher Reproduzierbarkeit unter Verwendung der stabilen Mikroinjektionsmethode aufgebaut werden. Deshalb haben wir zunächst eine Plattform für die Genombearbeitung bei Döbelmakrelen entwickelt, gefolgt von der Entwicklung einer V1a2-Knockout-Linie; Die Häufigkeit der Aggression gegenüber anderen Fischen wurde durch Filmdatenanalyse unter Verwendung von Bioimage-Informatik quantifiziert und das Merkmal durch Vergleich mit dem des Wildtyps bewertet.

Synthetisches Gonadotropin-Releasing-Hormon-Analogon (GnRHa) wurde 15 Frauen und 20 Männern intramuskulär verabreicht, wie in früheren Studien berichtet16. Döbelmakrelen laichen zwischen 21:00 und 01:00 Uhr aktiv, und das Befruchtungsfenster für die ovulierten Eier von Döbelmakrelen dauert nur wenige Stunden17. Das Laichen wurde alle 30 Minuten überwacht und die meisten der befruchteten Eier befanden sich im 1-Zellen-Stadium. Die Anzahl der gelegten Eier schwankte von Tag zu Tag, und wir konnten in einer Nacht höchstens mehr als 20.000 befruchtete Eier erhalten, und jede Nacht konnten mindestens etwa 1.000 befruchtete Eier gesichert werden (Abb. 1a). Die Laichmenge war in der ersten Hälfte des Überwachungszeitraums hoch und nahm in der zweiten Hälfte ab (Abb. 1a). Die Wassertemperatur lag während der Überwachung zwischen 17,7 und 21,2 °C.

Sammelsystem für befruchtete Eier von Döbelmakrelen. (a) Ergebnisse der Sammlung befruchteter Eier während der natürlichen Laichsaison 2015. Die blaue Spalte zeigt die Anzahl der täglich gesammelten befruchteten Eier. Das Balkendiagramm zeigt die Schwankung der Meerwassertemperatur während des Zeitraums. (b) Umgebungsbedingungen für die künstliche Reifung. (c) Eierstockabschnitt von Weibchen, die durch Umweltkontrolle künstlich gereift sind (oben) und In-vitro-Bioassay-Ergebnisse mit Zugabe von humanem Choriongonadotropin (unten). Eierstockproben wurden über Nacht in Bouin-Lösung fixiert, in einer Reihe von Ethanollösungen (bis zu 100 %) dehydriert, in Paraffin eingebettet, mit einem HM 355S-Mikrotom (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bei 6 μm geschnitten und mit gefärbt Hämatoxylin und mit Eosin gegengefärbt. Die zerkleinerten Eierstockstücke wurden in L15-Medium (Thermo Fisher Scientific) mit 100 IE humanem Choriongonadotropin (ASKA Pharmaceutical, Tokio, Japan) überführt und 24 Stunden lang bei 18,5 °C kultiviert. Rote Pfeile zeigen Eier mit Keimbläschenzerfall an. (d) Die Anzahl der befruchteten Eier, die beim Laichen im Winter 2016 gesammelt wurden. Die frühe Eisammlung wurde durch Anpassung der Umgebung durchgeführt. (e) Laichzeit von Döbelmakrelen unter natürlicher (oberer Balken) oder künstlich umgekehrter Tag-Nacht-Photoperiode (unterer Balken). Schwarze und gelbe Balken repräsentieren die Tages- bzw. Nachtzeiten. (f) Zeitpunkt, zu dem das befruchtete Ei gewonnen wurde, wobei Tag und Nacht des Laichbeckens vertauscht sind.

Als nächstes verlängerten wir die Laichzeit. Döbelmakrelen sind saisonale Brutfische, und im Ostchinesischen Meer in der Nähe der Insel Kyushu kommt es im Frühjahr bis Frühsommer zum mehrfachen Laichen, wenn die Meerwassertemperatur zwischen 16 und 22 °C liegt18. Deshalb haben wir versucht, die Laichzeit durch Anpassung der Umgebung zu verschieben. Mitten im Winter wurden geschlechtsunreife Döbelmakrelen-Elternfische in einem an die Umgebung anpassbaren Becken aufgezogen, in eine Langzeitphotoperiode mit 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit gesetzt und die Wassertemperatur auf die Laichtemperatur erwärmt. Jahreszeitentemperatur (Abb. 1b, Details im Abschnitt „Methoden“ beschrieben). Es wurde festgestellt, dass mehr als 80 % der Weibchen Anfang Februar Eier mit vollständiger Vitellogenese besaßen, wenn die Wassertemperatur normalerweise die niedrigste im Jahr wäre (Abb. 1c, oben). In einem In-vitro-Bioassay mit Zugabe von humanem Choriongonadotropin wurde in den Eiern der Abbau von Keimbläschen induziert, was darauf hindeutet, dass sie über das endgültige Reifepotenzial der Eizellen verfügen (Abb. 1c unten). Nach der Verabreichung von GnRHa an 14 künstlich gereifte Weibchen und 16 Männchen am 20. Februar 2016 wurde das Laichen am nächsten Tag bestätigt (Abb. 1d). Während der 11-tägigen Überwachung wurden täglich befruchtete Eier entnommen (Abb. 1d).

Da bei der frühen Eisammlung ein von einem Verdunklungsvorhang umgebener Tank zur Kontrolle der Umgebung verwendet wurde, haben wir versucht, den zirkadianen Rhythmus der Döbelmakrele zu ändern, indem wir den Hell-Dunkel-Zyklus der natürlichen Umgebung umkehrten (Abb. 1e). Nach einer Woche Photoperiodenumkehr konnten ab dem ersten Laichtag tagsüber befruchtete Eier gewonnen werden, was auf eine erfolgreiche Umkehr der ursprünglichen Laichzeit schließen lässt (Abb. 1f). Das Laichen konzentrierte sich zwischen 2 und 3 Stunden nach dem Ausschalten der Lichter, was wahrscheinlich 21:00 und 22:00 Uhr abends zur normalen Laichzeit entsprach (Abb. 1f).

Befruchtete Döbelmakreleneier begannen etwa 50–60 Minuten nach der Befruchtung mit der Zellteilung (Spaltung) und teilten sich dann alle 10–15 Minuten (Abb. 2a). Eine Verzögerung der Spaltung wäre unerlässlich, da sich häufig herausstellt, dass diese schon begonnen hat, wenn befruchtete Eizellen gesammelt und zur Vorbereitung für die Injektion ins Labor gebracht wurden. Die gesammelten befruchteten Eier wurden in mit Meerwasser gefüllte Petrischalen bei verschiedenen Temperaturen von 18 °C (natürliche Wassertemperatur) bis 4 °C überführt. Ungefähr 30 Eier wurden zufällig alle 10 Minuten zwischen 20 und 50 Minuten bei jeder Temperatur entnommen und mikroskopisch auf den Anteil der Eier im 1-, 2- und 4-Zellen-Stadium untersucht. Zu jedem Zeitpunkt war der Anteil der Eier im 1-Zellen-Stadium umso höher, je niedriger die Wassertemperatur war (Abb. 2b). Bei den Eiern, die bei natürlicher Wassertemperatur inkubiert wurden, betrug das Verhältnis von Eiern im 1-Zellen-Stadium zu allen überprüften Eiern jedoch nach 20 Minuten etwa 30 % und nach 50 Minuten weniger als 10 % (Abb. 2b). Der Anteil der Eier, die sich nach dem 4-Zellen-Stadium entwickelten, nahm mit steigender Wassertemperatur zu und lag bei natürlicher Wassertemperatur nach 30 Minuten bei 40 % und nach 50 Minuten bei 70 % oder mehr (Abb. 2b). Der Prozentsatz an Eiern im 1-Zellen-Stadium nach 50 Minuten war bei Eiern, die in Meerwasser unter 9 °C inkubiert wurden, signifikant höher als bei Eiern, die bei natürlicher Wassertemperatur inkubiert wurden (Abb. 2c). Nach 50-minütiger Eisammlung in Meerwasser bei 9 °C verblieben etwa 70 % der Eier im 1-Zellen-Stadium, während bei 4 °C und 6 °C mehr als 90 % der Eier im 1-Zellen-Stadium verblieben (Abb. 2c). Es gab keinen signifikanten Unterschied im Prozentsatz der Eier im 1-Zellen-Stadium bei den drei Temperaturen (4, 6 und 9 °C; Abb. 2c). Eier, die 50 Minuten lang bei jeder Temperatur inkubiert wurden, wurden schließlich auf die natürliche Wassertemperatur von 18 °C zurückgebracht und die normale Schlupffähigkeit wurde untersucht. In den Inkubationsgruppen bei 18 °C und 9 °C betrug die normale Schlupfrate etwa 60 %, und es gab keinen Unterschied zwischen verschiedenen Temperaturen. Andererseits schlüpften Eier, die in Meerwasser bei 4 °C und 6 °C inkubiert wurden, kaum und hörten mitten in der Entwicklung auf (Abb. 2c). Wenn die Eier daher bei einer niedrigen Temperatur von 6 °C oder niedriger inkubiert wurden, wurde die Entwicklung eher gestoppt als verzögert. Durch Lagerung der gesammelten Eier in Meerwasser bei 9 °C konnte die Spaltung verzögert werden, ohne die normale Schlupfrate wesentlich zu beeinträchtigen. Als nächstes untersuchten wir die Lagerzeit der gesammelten Eier in Meerwasser bei 9 °C. Nach der Entnahme wurden die befruchteten Eier sofort in 9 °C warmes Meerwasser überführt, 50–120 Minuten lang inkubiert, auf die normale Wassertemperatur von 18 °C gebracht und auf ihre Schlupfrate untersucht. Bei Lagerung in Meerwasser bei 9 °C für 60 Minuten oder länger war die normale Schlupfrate im Vergleich zu Eiern bei natürlicher Wassertemperatur deutlich verringert (Abb. 2e). Als die Eier 120 Minuten lang in Meerwasser bei 9 °C gelagert wurden, schlüpften sie kaum, selbst als die Wassertemperatur wieder normal war (Abb. 2e). Daher wurde davon ausgegangen, dass die Dauer, für die sie in Meerwasser bei 9 °C gelagert werden könnten, um die Spaltung zu verzögern, höchstens 60 Minuten beträgt. Der Prozentsatz an Eiern im 1-Zellen-Stadium lag nach 50-minütiger Inkubation in Meerwasser bei 9 °C bei nahezu 70 %, und da die Injektion fortgesetzt werden konnte, während allmählich die natürliche Wassertemperatur wiederhergestellt wurde, konnte die normale Injektionszeit auf bis zu zwei verlängert werden oder dreimal.

Mikroinjektion in Embryonen von Döbelmakrelen. (a) Spaltung befruchteter Eier von Döbelmakrelen. (b) Prozentsatz der Eier im 1-Zellen-Stadium zu jedem Zeitpunkt (links) und Prozentsatz der Eier, die das 4-Zellen-Stadium oder später erreichten (rechts), als die gesammelten befruchteten Eier in Meerwasser bei verschiedenen Temperaturen inkubiert wurden (n = 3). (c) Prozentsatz der Eier im 1-Zellen-Stadium, wenn die gesammelten befruchteten Eier 50 Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen in Meerwasser gelegt wurden. Unterschiedliche Buchstaben über den Balken stellen signifikante Unterschiede (P < 0,05) in den Daten bei verschiedenen Inkubationstemperaturen dar. (d) Normale Schlupfrate, wenn die gesammelten befruchteten Eier 50 Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen in Meerwasser gelegt und dann zur Inkubation auf die natürliche Meerwassertemperatur von 18 °C zurückgebracht wurden. Unterschiedliche Buchstaben über den Balken stellen signifikante Unterschiede (P < 0,05) in den Daten bei verschiedenen Inkubationstemperaturen dar. (e) Normale Schlupfrate, wenn die gesammelten befruchteten Eier für verschiedene Zeiträume von 50 bis 120 Minuten in Meerwasser bei 9 °C gelegt und dann zur Inkubation auf die natürliche Meerwassertemperatur von 18 °C zurückgebracht wurden. Sternchen weisen auf einen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe hin. **P < 0,01, ****P < 0,0001. (c–e) Die Daten werden als Mittelwert ± SEM (n = 3) ausgedrückt und durch eine einfache ANOVA gefolgt von einem Mehrfachvergleichstest der Türkei analysiert. (f) Lokalisierung des Farbstoffs in jedem Entwicklungsstadium, wenn der Fluoreszenzfarbstoff (200 mM KCl-Lösung mit 0,05 % Dextran, Rhodamin B) in das Eigelb oder Zytoplasma mikroinjiziert wurde. (g) Überleben des Embryos und normale Schlüpffähigkeit nach 24 und 48 Stunden Mikroinjektion in das Zytoplasma.

Als nächstes wurde die Injektionsstelle der Genom-Editierungslösung untersucht. Ein fluoreszierender Farbstoff wurde in das Eigelb oder Zytoplasma der befruchteten Eizelle injiziert und die Übertragung des Farbstoffs beobachtet. Der in das Eigelb injizierte Farbstoff blieb nach dem Schlüpfen sowohl in der Morula als auch in den Jungfischen an der Stelle des Eigelbs (Abb. 2f, links), wohingegen der in das Zytoplasma injizierte Farbstoff beim Embryo im Morula-Stadium beobachtet wurde und rote Fluoreszenz auftrat am gesamten Körper der Jungfische nach dem Schlüpfen beobachtet (Abb. 2f, rechts). Dies implizierte, dass in befruchteten Eiern von Döbelmakrelen keine zytoplasmatische Strömung auftrat und eine direkte Injektion in das Zytoplasma erforderlich war.

Die für die Mikroinjektion verwendete Glaskapillare wurde geschärft und auf einen Durchmesser von 1 µm verdünnt, um eine reibungslose Injektionsverabreichung zu ermöglichen. Aufgrund des hohen Innendrucks von Döbelmakreleneiern wäre eine Nadel mit einem kleinen Spitzendurchmesser erforderlich, um ein Austreten von Zytoplasma während der Injektion zu verhindern. Mit Farbstoff in die Keimscheibe infundierte Eier zeigten eine Überlebensrate von 86,5 % nach 24 und 48 Stunden im Vergleich zu unbehandelten Eiern (Abb. 2g). Die normale Schlupfrate betrug im Vergleich zu unbehandelten Eiern 76,5 %, was einer Überlebensrate von etwa 80 % entspricht (Abb. 2g).

Wir verwendeten die Transcription Activator-like Effector Nuclease (TALEN)-Technologie, um den V1a2-Knockout-Stamm zu erzeugen. Linke und rechte TALEN-mRNA mit einer Konzentration von jeweils 100 ng/μl wurden in das Zytoplasma von befruchteten Eiern im 1- oder 2-Zellen-Stadium mikroinjiziert. 24 Stunden nach der Injektion überlebten 591 befruchtete Eier, denen TALEN-mRNA mikroinjiziert worden war. Da alle Eier in einem Jungfisch-Aufzuchtbecken gehalten wurden, konnte die Anzahl der normalen Schlüpfvorgänge nicht ermittelt werden. Am 24. Tag nach dem Schlüpfen überlebten 52 Jungfische der Generation V1a2 KO F0. 5 Monate nach dem Schlüpfen überlebten 37 Fische, von jedem Fisch wurden Flossen gesammelt und genotypisiert. Die Analyse des Heteroduplex-Mobilitätsassays zeigte Mutationen in der Ziel-DNA aller Individuen (Abb. 3a). Es wurde eine Sequenzanalyse durchgeführt und ein Weibchen und zwei Männchen mit der höchsten Einführungsrate der Frameshift-Mutation wurden für die Produktion der F1-Generation ausgewählt (Abb. 3b). Bei Fischen wurde berichtet, dass viele Arten von Mutationen in einem Mosaikmuster bei F0-Individuen nach der Genombearbeitung vorliegen19. In den Zielgenomregionen der drei ausgewählten Fische wurden viele Frameshift-Mutationsmuster beobachtet (Abb. 3b).

Produktion der V1a2-Knockout-Linie. (a) Ergebnisse der Heteroduplex Mobility Assay (HMA)-Analyse aller V1a2 KO F0-Generationen, die 5 Monate alt waren. W steht für Wildtyp. NC zeigt eine Negativkontrolle an. (b) Die Gensequenz und Aminosäuresequenz der Zielstelle der F0-Generation, die eine besonders hohe Mutageneserate aufwies und für die Produktion der F1-Generation ausgewählt wurde (ein Weibchen und zwei Männchen). Die Etikettennummer (#) der Person entspricht der Nummer des HMA-Analyseergebnisses in (a). Es werden die Ausrichtungsergebnisse der durch Sequenzanalyse von 10 Klonen jedes Fisches erhaltenen Daten angezeigt. Die linken und rechten TALEN-Erkennungsbereiche werden gelb hervorgehoben. Δ zeigt eine Basendeletion an und Plus zeigt eine Baseninsertion an. *zeigt ein Stoppcodon an. (c) Als Ergebnis der Sequenzanalyse der Zielgenstellen aller F1-Fische, die 5–6 Monate nach dem Schlüpfen überlebten, wurden drei Muster fehlerhafter Mutation und zwei Muster der Baseninsertion bestätigt. (d) Aufschlüsselung der Mutanten beider Allele in allen sequenzierten F1-Fischen. Bei 30 Personen ist der Genotyp noch unbekannt, da keine eindeutigen Ergebnisse der Sequenzanalyse vorliegen.

Die F1-Generation entstand während der Laichzeit im Jahr 2018 und 468 Fische überlebten nach 5–6 Monaten Schlüpfen; Die Genotypen aller Fische wurden durch Sequenzanalyse bestätigt. Es wurden drei Arten defekter Mutationen und zwei Arten von Insertionsmutationen identifiziert (Abb. 3c). Der 13-Basen-Mangel (Δ13) sowie die 6-Basen- und 10-Basen-Insertionsmutationen (+6 und +10) waren Varianten, die durch Sequenzanalyse der Eltern der F0-Generation nicht bestätigt werden konnten (Abb. 3b). Dies lag wahrscheinlich daran, dass in jedem F0-Fisch nur 10 Klone sequenzanalysiert wurden und vielfältigere Mutationsmuster möglicherweise durch die Analyse weiterer Proben mittels Sequenzierungsanalyse der nächsten Generation bestätigt werden könnten. Von allen analysierten F1-Stämmen waren 46,4 % Wildtyp-Stämme, 42 % waren V1a2+/–, bei denen Mutationen in ein Allel eingeführt wurden, und 5,1 % waren V1a2–/–, was die Einführung von Mutationen in beide Allele bestätigte (Abb. 3d).

In der F2-Generation konnten nicht alle Fische zu V1a2 null gemacht werden; In der im Jahr 2020 produzierten F3-Generation waren jedoch alle Fische V1a2 null. Die Sequenzanalyse der Genotypen von 20 Jungfischen der F3-Generation unmittelbar nach dem Schlüpfen ergab fehlerhafte Mutationen in beiden Allelen bei allen Individuen (Abb. 4a). Die Mutationsmuster waren (Δ5, Δ5), (Δ13, Δ13) und (Δ5, Δ13) null (Abb. 4a); die Auftrittsraten betrugen 30 %, 25 % bzw. 45 %. Sowohl in den Δ5- als auch in den Δ13-Defektmustern gingen Cysteinreste, die die an der Zielstelle definierte SS-Brücke bildeten, aufgrund der Rasterverschiebung verloren (Abb. 4b). Im Falle einer 5-Basen-Deletion wurden schätzungsweise 54 Aminosäuren, die sich von normalem V1a2 unterscheiden, als Ergebnis einer Frameshift-Mutation produziert (Abb. 4b). Im Gegensatz dazu erschien im Fall eines 13-Basen-Mangels ein Stoppcodon unmittelbar nach der Mutationseinführungsstelle (Abb. 4b). Obwohl die heterozygote KO-Gruppe in beiden Allelen unterschiedliche Deletionsmuster aufwies, wurde angenommen, dass es V1a2 null war, da das Zielgen in beiden Allelen inaktiviert war. Bei den Jungfischen der F3-Generation wurde die Häufigkeit aggressiven Verhaltens durch phänotypische Analyse quantifiziert.

Etablierung der V1a2-Knockout-Linie. (a) Ergebnisse der Sequenzanalyse von Zielgenstellen in 20 Jungfischen der F3-Generation unmittelbar nach dem Schlüpfen. In beiden Allelen wurden bei allen Individuen Defektmutationen von 5 oder 13 Basen eingeführt, wodurch die V1a2–/–-Linie entstand. (b) Veränderungen in der V1a2-Aminosäuresequenz aufgrund von 5-Basen- und 13-Basen-Defektmutationen wurden in der F3-Generation bestätigt. Das Sternchen zeigt ein Stoppcodon an.

Wir haben ein Video-Content-Analysesystem entwickelt, das auf einer Biobild-Informatik-Technik zur objektiven und automatischen Überwachung von kannibalischem Verhalten in einer Jungfischgruppe basiert. Das System bestand aus einer Videokamera, die eine Brutgruppe in einem Becken aufnahm, und einer Computersoftware, die das aufgenommene Video analysierte (Abb. 5a). Die Software erkannte kannibalistische Verhaltensweisen als anomale Handlungen in der Brutgruppe. Durch Zählen der Häufigkeit anomaler Handlungen über einen bestimmten Zeitraum (z. B. eine Stunde) konnten wir beurteilen, wie oft kannibalisches Verhalten in diesem Zeitraum auftrat. Mit der Einführung dieser Software könnten Experimentatoren von der Mühe befreit werden, stundenlang Videodaten visuell zu überprüfen. Da die Bewertungsergebnisse zudem nicht von subjektiven Beobachtungen abhingen, konnten aus der Studie verlässliche Beweise gewonnen werden.

Phänotypische Analyse von Mutanten. (a) Videoaufnahmeumgebung für Fischbrut. Es wurden acht Sätze Videoaufnahmecontainer und Videokameras vorbereitet, sodass in allen acht Containern gleichzeitig Videos gedreht werden konnten. Zur Aufnahme ihres Schwimmbildes wurde ein weißer, glatter, runder Behälter (LB-4139; Nitori, Hokkaido, Japan) mit einem Durchmesser von 35 cm und einem hohen Kontrast zur Farbe des Rückens der Jungfische verwendet. Am oberen Teil jedes Pools wurde eine USB-Videokamera (HD Pro Webcam C920r; Logicool, Tokio, Japan) mit einer Bildrate von 30 Bildern pro Sekunde und einer Bildauflösung von 1280 × 720 angeschlossen, die an einen PC angeschlossen war, und es wurden Videos aufgezeichnet. (b) Normales Schwimmverhalten der Jungfische (rechts) und der Moment des kannibalischen Verhaltens, in dem die Gruppe der Jungfische gestört wird (links). (c) Ein Beispiel für den Analyseergebnisbildschirm der Software; 900 Pixel sind horizontal und 120 Pixel vertikal angeordnet. Ein Pixel ist ein Einzelbild eines bewegten Bildes, das alle 1/30 s in ein Standbild aufgeteilt wird. Bei der Analyse bewegter Bilder über eine Stunde ergaben sich 108.000 Einzelbilder. (d) Häufigkeit kannibalischen Verhaltens pro Stunde. *P = 0,0229. (e) Dauer der Aggression bei einem kannibalischen Verhalten. (f) Die Anzahl der Kollisionen mit der Behälterwand pro Stunde. (g) Sauerstoffverbrauch von WT- und KO-Braten über 2 Stunden in den Videoaufnahmebecken. ***P = 0,0004. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM [n = 25 (WT) und 21 (KO)] ausgedrückt und mit einem ungepaarten zweiseitigen Student-T-Test gefolgt von einem F-Test analysiert. WT-Wildtyp, KO-Knockout.

Döbelmakrelenbrut schwimmt normalerweise in Gruppen in die gleiche Richtung und die Software wertet diesen Schwimmstatus als Merkmalsvektor aus (Details werden unter „Ergänzende Informationen“ beschrieben). Die Vektoren bei kannibalischem Verhalten unterscheiden sich von denen bei normalem Verhalten, da kannibalisches Verhalten oft sehr große und verstreute Bewegungen der Jungfische zeigt (Abb. 5b). Abbildung 5c ​​zeigt ein Beispiel für den Ergebnisbildschirm der Softwareanalyse, bei dem es sich um eine zweidimensionale Darstellung der Videodaten jeder Stunde handelt. Die Videodaten wurden alle 1/30 s in ein Standbild aufgeteilt. Ein Pixel auf dem Ergebnisbildschirm repräsentiert einen Frame. Das heißt, das Videoanalyseergebnis einer Stunde wurde in 108.000 Bildern angezeigt. Das Pixel oben links repräsentiert das erste Bild und das nächste rechts das zweite Bild. Wenn Sie 900 Bilder nach rechts (30 s) weitergehen, kehren Sie zum linken Rand zurück, gehen einen Schritt nach unten und gehen dann wieder 900 Bilder (30 s) nach rechts weiter. Unten rechts ist das 108.000ste Bild, also 3600 s (1 h) nach Beginn des Videos. Der Zeitpunkt, zu dem ein bestimmtes kannibalisches Verhalten auftrat, kann als Zeitstempel (weißes Pixel) im Videobild bestimmt werden, in dem der Anomalie-Merkmalsvektor erkannt wurde (Abb. 5c).

Die Verhaltensanalyse zeigte, dass die Häufigkeit kannibalischen Verhaltens pro Stunde in der V1a2-KO-Gruppe um 46 % geringer war als im Wildtyp, was einen signifikanten Unterschied darstellte (P = 0,0229) (Abb. 5d). Die Dauer der Aggression unterschied sich nicht signifikant im Vergleich zum Wildtyp (P = 0,34), war jedoch in der V1a2-KO-Gruppe um 26 % kürzer als im Wildtyp (Abb. 5e). Die Anzahl der Kollisionen mit der Wand unterschied sich ebenfalls nicht signifikant im Vergleich zum Wildtyp (P = 0,3186), war jedoch in der V1a2-KO-Gruppe um 39 % niedriger als in der WT-Gruppe (Abb. 5f). Die Messung der Menge an gelöstem Sauerstoff im Pool vor und nach der zweistündigen Videoaufnahme ergab, dass der Sauerstoffverbrauch in der V1a2-KO-Gruppe um 15 % niedriger war als im Wildtyp, was einen signifikanten Unterschied darstellte (P = 0,0004) (Abb. 5g). ).

Damit die Genombearbeitung bei Fischen effizient durchgeführt werden kann, muss unmittelbar nach der Befruchtung ein Genombearbeitungsreagenz in befruchtete Eier mikroinjiziert werden. Daher ist die effiziente Sammlung befruchteter Eizellen unmittelbar nach der Befruchtung ein großes technisches Problem. Unser Forschungszentrum (ABRIC) hat bereits ein effizientes Sammelsystem für befruchtete Eier und ein Mutantenproduktionssystem für die Japanische Sardelle (Engraulis japonicus), einen Meeresknochenfisch, entwickelt20. Bei der Döbelmakrele schreitet die Vitellogenese bei Weibchen, die in einem kleinen Landbecken von mehreren Kilolitern aufgezogen werden, ausreichend voran; Die endgültige Reifung der Eizelle und der Eisprung finden jedoch nicht statt. Bei Männern verläuft die Hodenreifung jedoch normal. Dies liegt daran, dass bei in Gefangenschaft gehaltenen Weibchen das luteinisierende Hormon (LH), das die endgültige Reifung der Eizellen fördert, zwar ausreichend in der Hypophyse produziert wird, GnRH1, das die LH-Freisetzung fördert, jedoch nicht vom Hypothalamus ausgeschieden wird16. Wenn GnRHa in die Rückenmuskulatur gefangener Weibchen injiziert wird, wird daher die endgültige Reifung der Eizellen induziert und das Laichen im Becken beginnt 34–36 Stunden nach der Verabreichung. Wenn die Meerwassertemperatur 23 °C übersteigt, beginnt die Regression der Eier und das Laichen endet17. Durch die Kontrolle der Brutumgebung kann die Laichzeit nach vorne verschoben und die Laichzeit geändert werden. Das hier eingerichtete experimentelle System zur Bearbeitung des Döbelmakrelen-Genoms stellt sicher, dass ungefähr ein halbes Jahr lang homogene Proben zu einem für den Experimentator geeigneten Datum und Zeitpunkt erhalten werden.

Die Injektionsmanipulation sollte während der frühen Embryogenese durchgeführt werden, meist bei einzelligen Eiern, kurz nach dem Laichen und der Befruchtung oder spätestens bei zweizelligen Eiern nach der ersten Spaltung. Die Verzögerung der Spaltung ist von größter Bedeutung, da die Spaltung in den meisten Fällen bereits begonnen hat, wenn die befruchteten Eizellen gesammelt und zur Vorbereitung der Injektion ins Labor gebracht werden. Durch die detaillierte Untersuchung der geeigneten Niedertemperaturbehandlungsbedingungen zur Verzögerung der Spaltung, der Form der Kapillaren und der Injektionsstelle konnte die Zeit für die Mikroinjektion auf etwa das Doppelte der herkömmlichen Zeit verlängert werden. Die Qualität der Eizellen hat jedoch großen Einfluss auf die Effizienz der Genombearbeitung. Bei vielen Fischarten legen ältere, größere und nährstoffreichere Eltern Eier von hoher Qualität und weisen eine höhere Überlebensrate der Jungfische auf21,22. Döbelmakrelen erreichen die Geschlechtsreife in einem Jahr; Ein großes Weibchen über zwei Jahren kann jedoch möglicherweise Eier von hoher Qualität legen23. Um mikroinjizierte Eier für die Genombearbeitung zu erhalten, wäre es wichtig, die Auswirkungen der laichenden Eltern auf die Mutter zu berücksichtigen.

Um gentechnisch veränderte Tiere durch Genomeditierung effizient zu etablieren, ist die Auswahl von Individuen mit dem gewünschten Genotyp und deren generationsübergreifende Züchtung unerlässlich. Der erste Faktor, der die Prozessschwierigkeit beeinflusst, ist die Keimbahnübertragungseffizienz von F0-Mosaiktieren. Genotypisierungsergebnisse unter Verwendung genomischer DNA, die aus der Schwanzflosse extrahiert wurde, legten nahe, dass die Wildtypsequenzen der drei für die Produktion der F1-Generation ausgewählten Eltern-F0-Generationen durchschnittlich 20 % der zehn analysierten Klone ausmachten. Andererseits ergab die Genotypisierung aller Individuen der F1-Generation, dass fast 50 % der Individuen vollständig vom Wildtyp waren, was höher war als die theoretische Schätzung. Insbesondere der Anteil der Personen mit eingeführten Mutationen in beiden Allelen der F1-Generation lag mit 5,1 % deutlich unter den Erwartungen. Da wir jedoch den Anteil der Genotypen in befruchteten Eiern oder Jungfischen unmittelbar nach dem Schlüpfen nicht untersucht haben, können wir die Effizienz der Übertragung von Mutationen auf die F1-Generation noch nicht im Detail diskutieren. Obwohl wir die Merkmale von V1a2+/−-Individuen nicht bewertet haben, könnte es selbst in den heterozygoten Knockouts einige Phänotypen mit geringer Aggression geben. Ein solcher Phänotyp kann bei der Koexistenz mit Wildtyp-Brutfischen von Nachteil sein, und viele V1a2+/−- und V1a2−/−-Individuen wurden in der Studie möglicherweise gemeinsam ausgewählt. Tatsächlich gab es in der F0-Generation der Roten Meerbrasse, bei der eine mosaikartige Genmutation durch Genombearbeitung eingeführt wurde, keinen signifikanten Unterschied in der Mutationseinführungsrate und im Verhältnis der Mutationstypen zwischen den Brustflossen und den Keimzellen8. Selbst bei Döbelmakrelen ist es unwahrscheinlich, dass sich die Effizienz der Mutationseinführung zwischen Schwanzflossen- und Keimzellen stark unterscheidet. Zum jetzigen Zeitpunkt gehen wir nicht davon aus, dass es in unserem experimentellen System ein Problem mit der stabilen Übertragung von Mutationen auf die nächste Generation geben könnte. Eine detaillierte Bewertung der Effizienz der Mutationseinführung in Keimzellen der F0-Mosaikgeneration wäre nützlich, wenn in Zukunft eine Genombearbeitung verschiedener Gene dieser Art durchgeführt werden soll.

Die phänotypische Analyse des V1a2-KO-Stamms ergab, dass die Häufigkeit aggressiven Verhaltens, einschließlich kannibalischem Verhalten, etwa halb so hoch war wie beim Wildtyp. Mit anderen Worten: Durch Genomeditierung von V1a2 wurde gemäß dem ursprünglichen Zweck dieser Studie erfolgreich ein Phänotyp erhalten, der im Brutstadium beherrschbar ist. Die Tatsache, dass das kannibalische Verhalten halbiert wurde, deutete darauf hin, dass die Überlebensrate der Jungfische mehr als doppelt so hoch sein könnte. Da die Überlebensrate ein wichtiger Faktor für die Saatgutproduktion ist, müsste in den nächsten Jahren ein detaillierter Vergleich der Produktionseffizienz zwischen Wildtyp- und V1a2-Mutanten wiederholt werden. Da der Mutant außerdem eine sanftere Persönlichkeit als der Wildtyp hat, wäre auch eine detaillierte Bewertung der Wachstumsrate und der Futtereffizienz erforderlich. Interessanterweise könnte neben der verringerten Häufigkeit von Kannibalismus ein unerwarteter Phänotyp vorliegen. Obwohl es keinen signifikanten Unterschied gab, verringerte sich die Häufigkeit von Kollisionen mit der Behälterwand aufgrund der sanften Eigenschaft tendenziell um etwa 40 %. Der Tod durch Kollision mit den Wänden von Meereskäfigen ist ein Problem für Thunfische, die aufgrund ihrer hohen Schwimmgeschwindigkeit eng mit der Döbelmakrele verwandt sind. Derzeit wird an der Entwicklung von Mutanten mit geringer Agilität geforscht24. Sanfte Merkmale können auch zu einer Verringerung der Kollisionssterblichkeit an Aquakulturstandorten beitragen. Darüber hinaus wurde vermutet, dass der V1a2-Mutantenstamm weniger Sauerstoff verbraucht als der Wildtyp-Stamm. Obwohl der Grund dafür noch unbekannt ist, geht man davon aus, dass die Menge an aktivem Schwimmen beim Mutanten geringer ist als beim Wildtyp. Weltweit wurden katastrophale Schäden an Aquakulturen aufgrund roter Fluten gemeldet25,26. Obwohl der genaue Mechanismus des Todes durch Rote Flut noch unbekannt ist, geht man davon aus, dass überwucherte, verursachende Algen den Fischen die Fähigkeit nehmen, Sauerstoff in ihrem Blut zu transportieren, was dazu führt, dass die Fische Schwierigkeiten haben und unter Sauerstoffmangel leiden, um Rote Fluten zu vermeiden27 . Der V1a2-Mutantenstamm könnte möglicherweise resistenter gegen hypoxische Bedingungen sein, beispielsweise wenn Red Tide auftritt, als der Wildtyp. Zukünftig sollen verschiedene Vorteile dieser Züchtungsmethode durch vielfältigere Merkmalsbewertungen verdeutlicht werden.

In dieser Studie wurde ein experimentelles System entwickelt, das eine effiziente Eisammlung und Genombearbeitung bei Döbelmakrelen ermöglicht. Döbelmakrelenbrut, dessen Genom in V1a2 bearbeitet wurde, zeigte nur halb so viel Kannibalenverhalten wie der Wildtyp. Die Züchtung dieser sanften und beherrschbaren Eigenschaft wäre äußerst vorteilhaft für die Domestizierung und effiziente Produktion von Wildfischen. Obwohl es uns andererseits gelungen ist, eine Döbelmakrelensorte mit einem sanften Charakter zu produzieren, haben wir nicht untersucht, ob sich die Überlebensrate verbessert hat, und in Zukunft sind weitere Untersuchungen erforderlich. Wir hoffen, dass die Einführung dieser Rasse zur Entwicklung einer stabilen und nachhaltigen Produktion von Meeresprodukten beitragen wird.

Um während der normalen Laichzeit befruchtete Eier zu erhalten, wurden im Mai 2015 zwei Jahre alte Fische, die von einer Fischfarm in der Präfektur Oita gekauft worden waren, in das Fischereiforschungslabor der Kyushu-Universität gebracht und in einen 3-kL-Betontank gebracht mit fließendem Meerwasser. Für das frühe Eiersammelexperiment wurden im Dezember 2015 zwei Jahre alte Fische von einer Fischfarm in der Präfektur Saga gekauft und zum ABRIC-Karatsu-Satelliten der Kyushu-Universität transferiert. Zur Laichinduktion wurde ein GnRHa [des-Gly10-(D-Ala6) LHRH Ethylamid, 400 μg/kg Körpergewicht; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA], suspendiert in Kakaobutter, wurde in den Rückenmuskel des Fisches injiziert. Die Laicheier wurden mit einem Netz gesammelt, das am Abfluss des Laichbeckens befestigt war. Da befruchtete Eier auf der Oberfläche des Meerwassers schwimmen, während unbefruchtete Eier sinken, wurden die gesammelten Eier in einen Messzylinder überführt und dort eine Weile stehen gelassen, um die befruchteten von den unbefruchteten Eiern zu trennen. Abschließend wurden die schwimmenden befruchteten Eier eingesammelt und gezählt.

Am 4. Dezember 2015 wurden die Fische in einen 5-kL-Tank aus faserverstärktem Kunststoff (FRP) mit Verdunkelungsvorhang umgesiedelt. Fünf 760-lm-LED-Lampen wurden an der Decke des Verdunkelungsvorhangs installiert und für eine Langzeit-Photoperiode (LD, 14L:10D) eingestellt. Mithilfe eines Timers wurden die Lichter so eingestellt, dass sie sich um 05:00 Uhr einschalteten und um 19:00 Uhr ausschalteten. Um nachts Kollisionen mit der Wand zu verhindern, wurde als Nachtlicht eine kleine LED-Glühbirne (45 lm) verbaut. Die Helligkeit nahe der Wasseroberfläche betrug bei allen Lichtern etwa 400 Lux. Die Wassertemperatur wurde mithilfe einer Titan-Heizspirale auf einen Wert zwischen 18 und 19 °C, entsprechend der Laichzeit, eingestellt. Um tagsüber befruchtete Eier zu erhalten, wurde die Photoperiode eine Woche vor der Laicheinleitung geändert, sodass das Licht um 07:00 Uhr ausgeschaltet und um 17:00 Uhr eingeschaltet wurde.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde unter Verwendung einer aus dem Gehirn hergestellten cDNA-Bibliothek als Matrize durchgeführt, um eine Teilsequenz von V1a2 aus dem abgeleiteten 1. Exon zu erhalten. Der Temperaturwechsel bestand aus einer anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 9 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen bei 95 °C für 15 Sekunden, 50 °C für 15 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden. Die verwendete Polymerase war die im AmpliTaq Gold 360 Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) enthaltene Polymerase, und der Inhalt des Reaktionsmixes entsprach den Anweisungen des Herstellers. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind wie folgt: Fw, 5ʹ-TGGTCGCCTTCTTCCAGGTGCTAC-3ʹ und Rv, 5ʹ-CCAATCATCCCGTTCTTACTCGCAG-3ʹ.

Platinum TALEN-Plasmide wurden mit dem Platinum Gate TALEN Kit (Addgene; Kit #1000000043) wie zuvor beschrieben konstruiert28; ptCMV-153/47-VR war ein Zielvektor. Das TALEN-Paar wurde entwickelt, um auf die S-S-Bindungsstelle abzuzielen, die die Konformation von V1a2 beibehielt. Die Zielsequenzen von TALENs sind wie folgt: links 5ʹ-TTCCGCTTCTATGGTCCA-3ʹ und rechts 5ʹ-TGGAGGTGTTTGACTAT-3ʹ. Um TALEN-mRNAs herzustellen, wurden die linken und rechten TALEN-Plasmide mit SmaI linearisiert und unter Verwendung eines QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Aarhus, Dänemark) gereinigt. mRNAs wurden mit dem mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA Kit (Thermo Fisher Scientific) bzw. dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert und gereinigt.

Mikronadeln wurden mit einem Micropipette Puller PC-10 (Narishige, Tokio, Japan) hergestellt, um ein Glasrohr mit einem Kern (GD-1; Narishige) zu strecken. Mit einem Mikroschleifer EG-400 (Narishige) wurde der Spitzendurchmesser auf etwa 1 μm verkleinert und die Nadelspitze auf einen spitzen Winkel von 20° geschärft. Die gesammelten befruchteten Eier wurden sorgfältig in den Rillen einer 1,5 %igen Agarose angeordnet, die in einer Kunststoff-Petrischale mit 15 cm Durchmesser unter einem Stereomikroskop gehärtet und mit gefiltertem Meerwasser gefüllt war. Als nächstes wurde eine 200 mM KCl-Lösung mit 0,05 % (Gew./Vol.) Dextran und Rhodamin B (Thermo Fisher Scientific) injiziert und die Lokalisierung des Farbstoffs in jedem Entwicklungsstadium untersucht. Bilder von Hellfeld-Eiern wurden mit einer Nikon DS-Fi2-Kamera (Nikon, Tokio, Japan) aufgenommen, die auf einem Stereomikroskop SZX7 (Olympus, Tokio, Japan) montiert war. Fluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop LSM-700 (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) aufgenommen.

Die F0-Generation wurde am 4. und 5. Mai sowie am 16. Juni 2017 produziert. Kurz nach dem Laichen wurden befruchtete Eier gesammelt und bei 9 °C in gefiltertem Meerwasser vorinkubiert, um die Embryonalentwicklung bis zur Mikroinjektion zu verzögern. Vor der Injektion wurde die TALEN-mRNA-Lösung mit 200 mM KCl-Lösung auf eine Konzentration von 100 ng/μl verdünnt und zur Visualisierung während der Mikroinjektion wurde Phenolrot (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) bis zu einer Endkonzentration von 0,25 % zugegeben. TALEN-mRNA wurde in die Keimscheiben von Eiern im 1- und 2-Zellen-Stadium injiziert, in einer 5-l-Glaskammer in sterilisiertes Meerwasser überführt und bei 18 °C inkubiert. Die Mikroinjektion wurde drei Tage lang durchgeführt und 591 Eier überlebten 24 Stunden nach der Injektion. Die überlebenden Eier wurden in einen 100-l-Polycarbonattank überführt.

Die Fische wurden mit 200 ppm 2-Phenoxyethanol (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan) betäubt und ein Teil der Schwanzflossen mit einer scharfen Schere abgeschnitten. Alle Personen wurden durch Einsetzen eines PIT-Tags (BIO8; Biomark, Boise, ID, USA) in den Rückenmuskel identifiziert. Um Indel-Mutationen nachzuweisen, wurde ein Heteroduplex-Mobilitätstest durchgeführt und Amplikons, die die Zielstelle enthielten, sequenziert. Die Flossen wurden in alkalischer Lösung (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA) 5 Minuten lang bei 98 °C lysiert und mit einem Neutralisator (1 M Tris-HCl, pH 6,8) neutralisiert. Ein kurzes Fragment, einschließlich der Zielstelle der TALENs, wurde durch PCR amplifiziert. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind wie folgt: Fw, 5ʹ-CACCTCAGACCTGGCCGAC-3ʹ und Rv, 5ʹ-ACGGTCCAGGGTCATCATCAC-3ʹ. Die resultierenden Amplifikate wurden auf einem 15 %igen Polyacrylamidgel (Fujifilm) einer Elektrophorese unterzogen. Das PCR-Produkt wurde gereinigt, an den pGEM-T-Easy-Vektor (Promega, Madison, WI, USA) ligiert, in JM109-kompetente Zellen (Takara, Shiga, Japan) transformiert und letztere auf Agarmedium ausgebreitet. Die erhaltenen Kolonien wurden zufällig ausgewählt, eine PCR durchgeführt und etwa 10 transformierte Kolonien sequenziert (Eurofins Genomics Japan, Tokio, Japan). Die Proben wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Mehrere Alignments von Gensequenzen wurden mit der Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) X-Software (Version 10.1.8) unter Verwendung des ClustalW-Algorithmus (https://www.megasoftware.net) von MEGA erlaubt, spontan in 3- oder 5-kL-Innentanks an Land für die Produktion der nächsten Generation zu laichen.

Die Verhaltensanalyse wurde mit Jungfischen der F3-Generation (22 Tage nach dem Schlüpfen; durchschnittliche Körperlänge 29,04 ± 1,05 mm; durchschnittliches Körpergewicht 0,27 ± 0,03 g) durchgeführt, bei denen V1a2 in beiden Allelen ausgeschaltet war. Die verwendeten WT-Vergleichsfische waren 20 Tage nach dem Schlüpfen alt und hatten eine durchschnittliche Körperlänge von 31,6 ± 1,13 mm und ein durchschnittliches Körpergewicht von 0,28 ± 0,03 g. In einem 500-l-Polycarbonattank aufgezogene Jungfische wurden vorsichtig mit einem Netz aufgeschöpft und in einen Behälter mit 5 l Meerwasser gegeben (Abb. 5a). Die Wassertiefe betrug etwa 15 cm. Da während der Videoaufnahme keine Belüftung möglich ist, wurde etwa 20 Minuten lang langsam Sauerstoff in das Becken injiziert, so dass der gelöste Sauerstoffgehalt im Wassertank 15 mg/l betrug, um Sauerstoffmangel zu verhindern. Da die Analysesoftware nur bis zu 15 Jungfische verfolgen konnte, wurden zehn relativ große und fünf relativ kleine Jungfische visuell für das Experiment ausgewählt, um die Möglichkeit von Kämpfen sicherzustellen. Die Fenster im Raum waren mit einem Verdunklungsvorhang abgedeckt, um das Eindringen von Außenlicht zu verhindern, und die Raumtemperatur wurde auf 19 °C eingestellt, was der natürlichen Meerwassertemperatur nachempfunden ist. Um die Reflexion von Fluoreszenzlicht auf der Wasseroberfläche des Beckens zu verhindern, wurden vier LED-Flutlichter (LD106; Good Goods, Osaka, Japan) an der weißen Wand beleuchtet (Abb. 5a). Das Video wurde in jedem Pool 120 Minuten lang gedreht; Die ersten 30 Minuten dienten der Akklimatisierung und die letzten 30 Minuten dienten der Beobachtung der geschwächten Fische. Die restlichen 60-minütigen Videodaten wurden zur Analyse verwendet. Das Video wurde an vier aufeinanderfolgenden Tagen aufgezeichnet und Videodaten zur Analyse wurden insgesamt 25 Stunden lang in der WT-Gruppe und 21 Stunden lang in der KO-Gruppe erfasst, was etwa einem Tag in einem Brutbecken für Jungfische entspricht. In der KO-Gruppe verloren wir 4 Stunden Videodaten aufgrund einer unerwarteten Datenbeschädigung. Die Menge an gelöstem Sauerstoff im Pool wurde in allen Behältern zu Beginn und am Ende der Bildgebung mit einem Sauerstoffmessgerät (YSI ProSolo; Xylem, Kanagawa, Japan) gemessen und der Sauerstoffverbrauch berechnet. Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien für Tierversuche der Universität Kyushu durchgeführt und die Versuchsprotokolle wurden vom Tierversuchsausschuss der Universität Kyushu genehmigt. Unser Manuskript bestätigt, dass die Studie gemäß den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) berichtet wurde.

Das detaillierte Prinzip der Erkennung abnormalen Verhaltens wird in der Zusatzdatei erläutert.

Für die Diagrammerstellung und Datenanalyse wurde Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) verwendet.

Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten Sequenzinformationen sind im Repository der DNA Data Bank of Japan (DDBJ) verfügbar [Zugangsnummer: LC722364].

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Die Autoren möchten den Mitarbeitern von ABRIC für ihre Unterstützung bei der Erhaltung der Fischarten und den Mitarbeitern des Fischereiforschungslabors (Universität Kyushu) für ihre freundliche Hilfe bei dieser Studie danken. Diese Arbeit wurde durch folgende Zuschüsse unterstützt: Ministerübergreifendes Programm zur Förderung strategischer Innovationen (SIP), unterstützt vom Kabinettsbüro; Gemeinsamer Forschungsfonds für ein Forschungsprojekt zur Schaffung neuer Fischereiressourcen, unterstützt von der Stadt Karatsu; Zuschüsse für wissenschaftliche Forschung (KAKENHI: JP15H02459; JP16H06280; JP19H00951), unterstützt vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT), Japan; Forschungsunterstützungsstipendium, unterstützt vom Education and Research Center for Mathematical and Data Science, Kyushu University (Japan).

Aqua-Bioresource Innovation Center (ABRIC) Karatsu Satellite, Fakultät für Landwirtschaft, Kyushu-Universität, Saga, 847-0132, Japan

Hirofumi Ohga

Labor für Meeresbiologie, Fakultät für Landwirtschaft, Kyushu-Universität, Fukuoka, 819-0395, Japan

Koki Shibata, Ryo Sakanoue, Takuma Ogawa, Satoshi Kai und Kohei Ohta

Dritte Fischereigruppe, Forschungs- und Entwicklungszentrum für Meeresfischerei, Japan Fisheries Research and Education Agency (FRA), Kanagawa, 221-8529, Japan

Hajime Kitano

Labor für Aquakultur, Fakultät für Landwirtschaft, Universität Miyazaki, Miyazaki, 889-2192, Japan

Naoki Nagano

Human Interface Laboratory, Fabrik für Informationswissenschaft und Elektrotechnik, Kyushu-Universität, Fukuoka, 819-0395, Japan

Tomoya Nagasako und Seiichi Uchida

Labor für Molekulargenetik, Graduate School of Integrated Sciences for Life, Universität Hiroshima, Hiroshima, 739-8526, Japan

Tetsushi Sakuma und Takashi Yamamoto

Labor für molekulare Gentechnik, Fakultät für Landwirtschaft, Kyushu-Universität, Fukuoka, 812-8581, Japan

Sangwan Kim, Kosuke Tashiro und Satoru Kuhara

Planungs- und Koordinierungsabteilung, Fisheries Technology Institute, FRA, Nagasaki, 851-2213, Japan

Koichiro Gen

Abteilung für Aquatische Zucht, Forschungsabteilung für Aquakultur, Institut für Fischereitechnologie, FRA, Mie, 516-0193, Japan

Atushi Fujiwara

Fisheries Technology Institute, Minamiizu Field Station, FRA, Shizuoka, 415-0156, Japan

Yukinori Kazeto

Abteilung für Aquatische Zucht, Forschungsabteilung für Aquakultur, Institut für Fischereitechnologie, FRA, Kanagawa, 236-8648, Japan

Takanori Kobayashi

ABRIC, Fakultät für Landwirtschaft, Kyushu-Universität, Fukuoka, 819-0395, Japan

Michiya Matsuyama

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HO leitete den gesamten Forschungsprozess und verfasste das Originalmanuskript. HO, KS, RS und TO waren an der Einrichtung der Versuchssysteme, der Schaffung des Knock-out-Stammes und der Merkmalsbewertung beteiligt. HK leistete technische Zusammenarbeit bei der Zucht mutierter Jungfische. S. Kai, KO und NN leisteten technische Hilfe. TN und SU entwickelten die Videoanalysesoftware und verfassten den technischen Teil des Manuskripts. TS und TY konstruierten TALEN für die Genombearbeitung. S.Kim, KT und S.Kuhara waren an der Erfassung von Genomsequenzen beteiligt. KG, AF, YK und TK waren an der Sammlung von Genominformationen und der Zielgenauswahl beteiligt. MM entwarf das Konzept, half bei der Dateninterpretation und überwachte diese Studie. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Michiya Matsuyama.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ohga, H., Shibata, K., Sakanoue, R. et al. Entwicklung einer Döbelmakrele mit weniger aggressivem Brutstadium durch Genomeditierung des Arginin-Vasotocin-Rezeptors V1a2. Sci Rep 13, 3190 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30259-x

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Eingegangen: 02. August 2022

Angenommen: 20. Februar 2023

Veröffentlicht: 23. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30259-x

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