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Jul 02, 2023

Systematische Charakterisierung von Reinräumen

Microsystems & Nanoengineering Band 8, Artikelnummer: 54 (2022) Diesen Artikel zitieren 2499 Zugriffe 2 Zitate 1 Details zu altmetrischen Metriken Integrierte Ventile ermöglichen eine automatisierte Steuerung in der Mikrofluidik

Microsystems & Nanoengineering Band 8, Artikelnummer: 54 (2022) Diesen Artikel zitieren

2499 Zugriffe

2 Zitate

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Integrierte Ventile ermöglichen eine automatisierte Steuerung in mikrofluidischen Systemen, da sie zum Mischen, Pumpen und Kompartimentieren eingesetzt werden können. Eine solche Automatisierung wäre für Anwendungen in Organ-on-Chip-Systemen (OoC) von großem Wert. Allerdings haben OoC-Systeme typischerweise Kanalabmessungen im Bereich von Hunderten von Mikrometern, was eine Größenordnung größer ist als die von typischen Mikrofluidikventilen. Der am häufigsten verwendete Herstellungsprozess für integrierte, normalerweise offene Ventile aus Polydimethylsiloxan (PDMS) erfordert einen Reflow-Fotolack, der die erreichbare Kanalhöhe begrenzt. Darüber hinaus erschweren die geringen Hubvolumina dieser Ventile das Erreichen von Durchflussraten von Mikrolitern pro Minute, die typischerweise in OoC-Systemen erforderlich sind. Hier stellen wir ein mechanisches „Makroventil“ vor, das durch mehrschichtige Softlithographie unter Verwendung mikrogefräster Direktformen hergestellt wird. Wir zeigen, dass diese Ventile abgerundete Kanäle mit einer Höhe von bis zu 700 µm und einer Breite von 1000 µm verschließen können. Darüber hinaus haben wir mit diesen Makroventilen eine Schlauchpumpe mit einer Pumprate von bis zu 48 µL/min und ein Misch- und Dosiergerät geschaffen, das die vollständige Durchmischung eines Volumens von 6,4 µL innerhalb von nur 17 s erreichen kann. Ein erstes Zellkulturexperiment zeigte, dass ein Gerät mit integrierten Makroventilen biokompatibel ist und die Zellkultur von Endothelzellen über mehrere Tage unter kontinuierlicher Perfusion und automatisierter Mediumauffrischung ermöglicht.

Organ-on-Chips (OoCs) werden üblicherweise als mikrofluidische Zellkulturgeräte definiert, die zwei unabhängig adressierbare, parallele Kanäle enthalten, die durch eine poröse Membran getrennt sind. Auf beiden Seiten der Membran können verschiedene Zelltypen kultiviert werden, was zu einer komplexen, organspezifischen Gewebe-Gewebe-Schnittstelle führt1,2. OoC-Geräte gelten als leistungsstarke Alternative zu herkömmlichen In-vitro- und Tiermodellen3. Allerdings ist die Durchführung von On-Chip-Zellkulturexperimenten nicht trivial. OoCs können arbeitsintensiv und schwierig in der Anwendung sein, da sie Erfahrung sowohl in der Mikrofluidik als auch in der Zellkultivierung erfordern4,5.

Um OoCs von Proof-of-Concept-Geräten in kommerzielle Systeme zu übertragen, z. B. Arzneimittelscreening und personalisierte Medizin, ist es entscheidend, dass die OoC-Systeme einen höheren Durchsatz haben. Multiplex-OoCs sind ein vielversprechender Ansatz zur Steigerung des Durchsatzes von OoC-Experimenten5,6. In den letzten Jahren wurden mehrere Mikrofluidiksysteme mit einem höheren Grad an Parallelisierung oder Durchsatz vorgestellt, aber jedes von ihnen hat seine eigenen Nachteile. Mimetas OrganoPlate® ist beispielsweise ein System mit 40 bis 96 unabhängigen Kulturvertiefungen oder OoCs7. Allerdings sind viele Pipettierschritte erforderlich, um jeden einzelnen Chip zu füllen, die Zellkulturfläche ist klein und der Aufbau erfordert die Verwendung eines Hydrogels (als semipermeable Barriere und/oder als Zellsubstrat). Zakharova et al. zeigte ein Beispiel für ein Design mit einem gemeinsamen Eingang und acht parallelen Ausgängen, mit dem ein höherer Durchsatz erreicht werden kann, aber immer noch viel manuelle Handhabung erforderlich ist8.

Systeme mit integrierten Mikrofluidikventilen werden häufig verwendet, um den Bedarf an manueller Flüssigkeitshandhabung zu reduzieren, wie beispielsweise die von Vollertsen et al.9,10 gezeigten. Bei diesen Systemen kommen häufig integrierte, normalerweise offene Ventile zum Einsatz11, da die Ventile sowohl einfach herzustellen sind als auch im Vergleich zu normalerweise geschlossenen Ventilen einen geringen Platzbedarf im Verhältnis zu den Kanalbreiten haben12,13. Im Jahr 2000 stellten Unger et al. stellte ein normalerweise offenes PDMS-Ventil vor, das derzeit häufig verwendet wird und auch als Quake-Style-Ventile bekannt ist12. Diese Mikroventile sind ein wesentliches Werkzeug für die automatisierte Steuerung in der Mikrofluidik, da sie für Misch-, Pump- und Multiplexzwecke in einem breiten Anwendungsspektrum eingesetzt werden können9,10,14,15. Obwohl diese mikrofluidischen Großintegrationssysteme (mLSI) einen höheren Durchsatz ermöglichen, sind sie nicht mit den großen Kanaldimensionen kompatibel, die zur Aufnahme relevanter Zellkulturen in OoCs erforderlich sind.

Der ursprüngliche Herstellungsprozess von Ventilen im Quake-Stil basiert auf einem Reflow-Fotolack, um abgerundete Kanäle für die vollständige Abdichtung der Ventile zu erzielen, wodurch seine Anwendung auf Kanalhöhen von bis zu mehreren zehn Mikrometern beschränkt ist12. Dies macht die Ventile für die meisten OoC-Anwendungen ungeeignet, da OoCs häufig Kanäle mit einer Höhe und Breite von Hunderten von Mikrometern enthalten16,17,18,19,20. Darüber hinaus erfordern 3D-Zellkultursysteme, wie z. B. Zellsphäroide in einem PDMS-Chip, häufig Kanalabmessungen von Hunderten von Mikrometern21. Darüber hinaus können peristaltische Pumpen, die mit einem Reflow-Fotolack hergestellt werden, normalerweise nur Durchflussraten von 0,05 µL/min bis 0,15 µL/min erreichen12,14,22,23,24. Allerdings liegen die typischerweise in OoCs verwendeten Flussraten um eine Größenordnung höher und liegen zwischen 0,5 µL/min und 3,3 µL/min16,17,18,19,20,25, was bei Blutgefäßen auf Chips sogar noch höher sein kann physiologisch relevante Schubspannungen erreichen. Um die Vorteile der mLSI-Chip-Technologie in die OoC-Technologie zu übertragen, sind neue Herstellungsmethoden für normalerweise offene PDMS-Ventile erforderlich.

Obwohl die Verwendung von PDMS diskutiert wird13,26,27, bleibt es für viele Forschungsgruppen das Material der Wahl:28 Es ist einfach in Herstellungsprozessen zu verwenden (zum Gießen, zur Oberflächenbeschichtung und zum Verbinden mit PDMS oder Glas) und gasdurchlässig (ermöglicht die Diffusion von Sauerstoff zu den Zellen), ist kostengünstig und verfügt über eine hohe Elastizität (ermöglicht die Verwendung von Ventilen im Quake-Stil)13,26,29. Zuvor wurden neue Herstellungsmethoden mithilfe von Fotolithographie und 3D-Druck erforscht, um Ventile herzustellen, die Kanäle mit einer Höhe von Hunderten von Mikrometern verschließen können. Freitas et al.30 haben eine Methode zur Herstellung eines Ventils im Quake-Stil mittels Photolithographie mit einer maximalen Höhe und Breite von etwa 250 bzw. 400 µm gezeigt. Ihre Methode erfordert jedoch zusätzliche weiche Lithographieschritte und die Druckbeaufschlagung der Kanäle während der PDMS-Aushärtung30, was den Herstellungsprozess verkompliziert. Der 3D-Druck bietet auch eine Alternative zur Fotolithographie für die Herstellung von Ventilen im Quake-Stil, wie Lee et al.31 und Glick et al.32 gezeigt haben. Diese Ventile sind jedoch vollständig 3D-gedruckt und nicht aus PDMS gefertigt, was bedeutet, dass die Ventile nicht direkt in ein PDMS-OoC31 integriert werden können. Glick et al. und Compera et al. Beide zeigen ein Ventil im Quake-Stil, das einen 500 µm hohen bzw. 200 µm hohen Kanal verschließt, hergestellt durch 3D-gedruckte Direktformen32,33. Der 3D-Druck von Formen für die PDMS-Softlithographie stellt jedoch Herausforderungen hinsichtlich der Materialkompatibilität, der Oberflächenbeschaffenheit und der Unfähigkeit zum Dampfpolieren, der Auflösungsgrenze, der Wiederholbarkeit, der Benutzerfreundlichkeit und der Herstellungsgeschwindigkeit34 sowie der Verwendung eines Photovernetzers dar, der störend sein kann mit der Aushärtung von PDMS35,36.

Mikrofräsen ist eine sich schnell entwickelnde Rapid-Prototyping-Technik zur Herstellung mikrofluidischer Formen, die gegenüber 3D-Druck und Fotolithographie einzigartige Vorteile bietet. Mikrofräsen ist eine schnelle, vielseitige, reinraumfreie und damit kostengünstige Fertigungsmethode, die komplexe 3D-Geometrien innerhalb einer Form ermöglicht37. Eine mikrogefräste Form aus einem Kunststoff wie Polymethylmethacrylat (PMMA) ist fester und damit widerstandsfähiger als fragile Fotolack-Master, die besonders anfällig sind, wenn relativ große Fotolack-Strukturen erhalten werden. Darüber hinaus ist das Mikrofräsen von Formen weniger arbeitsintensiv als die Herstellung von Formen durch den herkömmlichen Prozess der Fotolithographie unter Verwendung von Reflow-Fotolack, der ebenfalls Erfahrung erfordert, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Obwohl bereits über mikrogemahlene Formen für PDMS-Makroventile berichtet wurde21,38, erfordern die entsprechenden Herstellungsverfahren eine Negativform und einen Doppelguss von PDMS auf PDMS21 oder einen Gießschritt aus Polyethylenterephthalat (PET)38. Darüber hinaus sind die Abmessungen dieser abgerundeten Kanäle durch die Verfügbarkeit kegelförmiger Fräswerkzeuge begrenzt21,38.

Unseres Wissens nach sind wir die ersten, die eine Methode beschreiben, bei der Mikrofräsen verwendet wird, um direkt eine Positivform für ein PDMS-Makroventil im Quake-Stil mit Abmessungen im Hunderter-Mikrometer-Bereich herzustellen. Unsere vorgeschlagene Methode ermöglicht es uns, eine Form mit einer aufrechten Struktur mit jeder gewünschten Form (z. B. zylindrisch oder elliptisch) und Größe (Höhe und Breite) zu erstellen, ohne durch die Formen und Größen der verfügbaren Kugel- oder Kegelmühlen eingeschränkt zu sein. Solche Direktpositivformen erleichtern und vereinfachen den Herstellungsprozess und minimieren den potenziellen Fehler, der durch PDMS-Schrumpfung im Vergleich zu den Doppelgussmethoden verursacht wird21,38. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgeschlagenen mikrogefrästen Direktformen zur Herstellung von Ventilen im Quake-Stil einen einfacheren Ansatz für die Kommerzialisierung von Formen und das Multiplexen von PDMS-OoCs ermöglichen.

In diesem Artikel zeigen wir eine völlig reinraumfreie Herstellungsmethode für PDMS-Makroventile im Quake-Stil, bei der Mikrofräsen zur Herstellung direkt positiver Formen verwendet wird. Die Steuerkanäle können sowohl Brücken zum Überqueren als auch Ventile zum Verschließen abgerundeter Strömungskanäle bilden. Darüber hinaus bieten wir einen Leitfaden zur Ventilkonstruktion durch systematische Charakterisierung der Brücken- und Ventilkanalhöhen, -breiten und Betätigungsdrücke. Die Makroventile können abgerundete Kanäle mit einer Höhe von bis zu 700 µm und einer Breite von 1000 µm verschließen. Für weitere Experimente wurde ein Makroventildesign (zum Verschließen eines 400 µm hohen und 1000 µm breiten abgerundeten Kanals) verwendet. Durch die Entwicklung sowohl einer peristaltischen Pumpe als auch eines Misch- und Dosiergeräts haben wir die Wirksamkeit des Makroventils demonstriert. Mit der Schlauchpumpe kann eine Pumprate von bis zu 48 µL/min erreicht werden, mit dem Misch- und Dosiergerät gelingt die vollständige Durchmischung eines Volumens von 6,4 µL innerhalb von nur 17 s. Ein zweites Ventildesign (zum Verschließen eines 200 µm hohen und 1000 µm breiten Kanals) wurde für ein Proof-of-Concept-Zellkulturexperiment verwendet, bei dem die Kultur von Endothelzellen über mehrere Tage unter peristaltischem Fluss in einem PDMS-Gerät gezeigt wurde, wodurch deren Biokompatibilität demonstriert wurde. Dieses Experiment demonstriert auch das Potenzial der Makroventile für den Einsatz in Multiplex-OoCs und ermöglicht die Automatisierung der Zellkultur in OoCs, was äußerst relevant ist, um OoC-Forschung mit höherem Durchsatz zu erreichen und gleichzeitig den Bedarf an manueller Flüssigkeitshandhabung zu reduzieren.

Die hergestellten Geräte mit integrierten Makroventilen (Abb. 1) bestanden alle aus drei Schichten (Abb. 1g): einem Glasobjektträger, einer dünnen PDMS-Schicht mit Kontrollkanälen, die von einer flexiblen PDMS-Membran (Kontrollschicht) bedeckt waren, und einer PDMS-Schicht mit abgerundetem Fließkanal (Fließschicht). Abbildung 1a, b zeigt einen Steuerkanal, der einen 1 mm breiten, 400 µm hohen, abgerundeten Strömungskanal kreuzt. Der Strömungskanal war mit blauer Lebensmittelfarbe gefüllt. War der Querschnitt des Steuerkanals mit dem Strömungskanal ausreichend breit, dehnte sich die Membran des Steuerkanals bei Druckbeaufschlagung in den Strömungskanal aus und verschloss diesen (Abb. 1b, c), wodurch das Ventil geschlossen wurde. Der (vereinfachte) Herstellungsprozess ist in Abb. 1d–g dargestellt. Direkt mikrogefräste Formen wurden zum Gießen des PDMS für die Fließschicht und zum Schleuderbeschichten des PDMS für die Kontrollschicht verwendet. Nach dem Vorhärten beider Schichten können sie nach Unger et al.12 ausgerichtet und auf einen Glasobjektträger geklebt werden.

a, b Mikroskopische Draufsichtbilder von: aa Steuerschicht mit offenem Ventil und Brücke, ba unter Druck stehendem Steuerkanal mit geschlossenem Ventil und Brücke, die den Strömungskanal nicht verschließt. Die abgerundeten Strömungskanäle enthalten blaue Lebensmittelfarbe und die Steuerkanäle enthalten Wasser. c Schematische Darstellung einer offenen und einer geschlossenen Klappe aus einer Querschnittsansicht an der Stelle der Klappe. Durch Druckbeaufschlagung des Steuerkanals (P ↑ ) schließt das Ventil. d–g Vereinfachte Darstellung des Herstellungsprozesses. d Zum Gießen von PDMS als Fließschicht wird eine mikrogefräste Form mit einer aufrechten, abgerundeten Struktur verwendet. e Als Kontrollschicht wird eine mikrogefräste Form mit rechteckigen Strukturen (Kontrollkanälen) verwendet. PDMS kann durch Schleuderbeschichtung auf die Form aufgetragen werden, was zu einer dünnen PDMS-Membran zwischen dem Steuerkanal und dem Strömungskanal führt. f PDMS kann vorgehärtet werden und die beiden Schichten können anschließend ausgerichtet werden. g Die Kontrollschicht wird auf einen Objektträger aus Glas geklebt. Das fertige Gerät besteht aus drei Schichten; ein Glasobjektträger, die Kontrollschicht und die Fließschicht

Um eine vollständige Abdichtung des Ventils zu erreichen, sollte der Strömungskanal ein abgerundetes, idealerweise glattes Profil haben. Es wurden Rasterelektronenmikroskop-Bilder (REM) aufgenommen, die eine treppenartige Struktur in der PMMA-Form zeigten (Abb. 2a, b), die durch das Fräsen dieser hervorstehenden abgerundeten Struktur entstanden ist. Mit einem Dektak-Profilometer (Veeco) wurde das Oberflächenprofil der gefrästen, abgerundeten Struktur in der PMMA-Form gemessen (Ergänzende Informationen S.2). Die vertikalen Stufen der treppenartigen Struktur wurden mit 10 µm gemessen. Ein Querschnitt eines PDMS-Abgusses des Strömungskanals ist in Abb. S1 dargestellt. Um die Oberflächenrauheit des Kanals zu reduzieren, wurde eine 5-minütige Chloroformbehandlung der PMMA-Formen gemäß Ogilvie et al.39 durchgeführt. (Ergänzende Informationen S.1, Lösung 1B). Die REM-Bilder (Abb. 2c, d) zeigen den glättenden Effekt der Lösungsmittelbehandlung auf der Oberfläche der abgerundeten hervorstehenden Struktur. Dieser Glättungseffekt wurde auch in einer Dektak-Messung der behandelten Form beobachtet (Ergänzende Informationen S.2, Abb. S3). Wir fanden heraus, dass die Ventile im geschlossenen Zustand leckagefrei waren (Nachweisgrenze: 10 nL/min) und unabhängig vom zusätzlichen Glättungsschritt zum Pumpen verwendbar waren. Daher haben wir keine Chloroformbehandlung für die systematischen Charakterisierungschips, die peristaltische Pumpe oder das Misch- und Dosiergerät verwendet. Die Formen für den Rezirkulationschip, der für die Zellkultivierung verwendet wird, werden geglättet.

REM-Bilder der PMMA-Form für den abgerundeten Strömungskanal: vor (a, b) und nach (c, d) Chloroform-Lösungsmittelbehandlung

a Schematische Draufsicht des Chips zur Charakterisierung. Dieser Chip wird in 4 Versionen mit jeweils einer festen Flusskanalbreite (250, 500, 750 oder 1000 µm) hergestellt. Die Fließkanalhöhe wird in % der Fließkanalbreite variiert, angezeigt durch den blauen Farbverlauf. Die Höhe des Steuerkanals ist pro Chipversion festgelegt und die Breite des Steuerkanals wird in % der Breite des Strömungskanals variiert. b Es wurden 4 Versionen des Chips hergestellt, wobei die feste Flusskanalbreite angegeben ist. c Ventilschließungen der 4 Chip-Versionen bei unterschiedlichen Betätigungsdrücken (angezeigt durch die 4 vertikalen Balken unten rechts: 1, 1,25, 1,5, 1,75 bar) (pro Bar, n = 9 bis 12). Die Ventilverschlüsse für die separaten Chip-Versionen (250, 500, 750 und 1000 µm Strömungskanalbreite) finden Sie in den Zusatzinformationen S.5

Eine systematische Charakterisierung von Ventilen mit unterschiedlichen Abmessungen und/oder Steuerleitungsdrücken stellt ein nützliches Designtool für die Herstellung von PDMS-Geräten mit verschiedenen Abmessungen und Anwendungen dar. Diese systematische Charakterisierung bestimmt die erforderliche Steuerkanalbreite für Bereiche von Strömungskanalbreiten und -höhen bei unterschiedlichen Betätigungsdrücken. Vier Charakterisierungschips (jeder mit 25 Querschnitten zwischen einem Steuerkanal und einem Strömungskanal) wurden entworfen und hergestellt. Für jeden Chip wurde die Breite des abgerundeten Strömungskanals festgelegt (250, 500, 750 oder 1000 µm breit; siehe Abb. 3a, b). Es wurde ein Höhenbereich für die Strömungskanäle untersucht, der als Prozentsatz (%) der Strömungskanalbreite angegeben wird. Darüber hinaus wurden fünf Steuerkanäle mit unterschiedlichen Breiten untersucht, die ebenfalls alle als Prozentsatz (%) der Strömungskanalbreite angegeben wurden. Querschnitte der PDMS-Abgüsse der mikrogefrästen Formen finden Sie in den Zusatzinformationen S.3 und S.4 für die Strömungs- bzw. Steuerkanäle.

Die Strömungskanäle wurden mit blauem Lebensmittelfarbstoff gefüllt und auf die Steuerkanäle wurde ein Bereich von Betätigungsdrücken (1, 1,25, 1,5 und 1,75 bar) ausgeübt. Die Kontroll-/Strömungskanalquerschnitte wurden unter einem Mikroskop auf das Vorhandensein von blauem Lebensmittelfarbstoff im Strömungskanal untersucht (wie in Abb. 1b dargestellt). Abbildung 3c zeigt den durchschnittlichen Prozentsatz des Ventilschließens für alle vier Chipversionen bei unterschiedlichen Betätigungsdrücken. Abbildung 3c zeigt, dass unsere vorgeschlagene Herstellungsmethode funktionierte, um Strömungskanäle unterschiedlicher Größe mit Höhen von bis zu 70 % der Breite zu verschließen. Bei einem schmalen Steuerkanal (Breite 10–12 % der Fließkanalbreite) war die Überbrückung eines Fließkanals nie ein Problem, solange die Fließkanalhöhe mehr als 20 % der Breite betrug. Zum Schließen schien ein Steuerkanal mit der Breite des Strömungskanals am stabilsten zu sein, hatte jedoch den Nachteil, dass er eine große Stellfläche benötigte. Wenn eine geringe Stellfläche bevorzugt wird, reicht bei höheren Betätigungsdrücken auch eine Steuerkanalbreite von 60 % der Strömungskanalbreite aus.

Da OoCs oft einen 1 mm breiten Kanal mit einer Höhe zwischen 150 µm und 1 mm haben16,17,18,19,20,25, haben wir uns entschieden, ein Ventil, das diesen OoC-Abmessungen entspricht, weiter zu untersuchen. Im Rest dieser Arbeit untersuchten wir das Ventilschließen eines 1000 µm breiten und 400 µm hohen Kanals, der im Folgenden als „Makroventil“ bezeichnet wird.

Das Schließverhalten des Makroventils wurde durch Anlegen unterschiedlicher Drücke an die Strömungs- und Steuerkanäle untersucht. Zwei Druckregler wurden verwendet, um einen Differenzdruck (dP) auf den Einlass und Auslass des Strömungskanals auszuüben, und ein Druckregler wurde verwendet, um Druck auf den Steuerkanal auszuüben. Ein Durchflusssensor in Reihe mit dem Ventil wurde verwendet, um den Durchfluss bei verschiedenen Drücken zu messen (siehe Abb. 4a). Durch Beaufschlagung der Steuerleitung mit mehr als 900 mbar konnte das Ventil für alle vier Eingangsdrücke im Bereich von 2,5 mbar bis 10 mbar geschlossen werden.

a Schließverhalten des Makroventils. Linien zur visuellen Orientierung. dP = Differenzdruck zwischen Einlass- und Auslassdruck des Strömungskanals, der variiert und durch die verschiedenen Farben angezeigt wird (n = 1). b Pumprate der Peristaltikpumpe bei verschiedenen Betätigungsfrequenzen und -drücken mit einem 6-Phasen-Muster (101, 100, 110, 010, 011, 001). Für alle drei Betätigungsdrücke ist ein linearer Zusammenhang zwischen der Pumprate und den Betätigungsfrequenzen zu beobachten. 1 bar, R2 = 0,9999 (n = 3); 1,2 bar, R2 = 0,9997 (n = 1); 1,5 bar, R2 = 0,9998 (n = 1). c Schematische Darstellung des 6-Phasen-Betätigungsmusters der Schlauchpumpe

Ventillecks wurden ebenfalls untersucht und sind in den Zusatzinformationen S.6 aufgeführt. Einfach ausgedrückt liegt die durchschnittliche Ventilleckage im Bereich von nL/min, was nur 0,1 % der Durchflussrate bei offenem Ventil entspricht, woraus wir schließen können, dass die Leckage eines geschlossenen Ventils für unsere Anwendungen vernachlässigbar ist.

Zur Herstellung einer peristaltischen Pumpe wurden drei aufeinanderfolgende Ventile verwendet. Die Pumprate der Schlauchpumpe wurde durch Betätigung der Ventile mit einem 6-Phasen-Muster (101, 100, 110, 010, 011, 001; schematisch dargestellt in Abb. 4c) bei verschiedenen Frequenzen untersucht. Abbildung 4b zeigt die lineare Reaktion zwischen der Betätigungsfrequenz und der Pumprate für jeden Betätigungsdruck. Bei einer Frequenz von 20 Hz wurde eine maximale Pumprate von 47,9 µL/min erreicht (siehe Abb. 4b). Die Messungen innerhalb einer Pumpe waren reproduzierbar, was durch die kleinen, fast unsichtbaren Fehlerbalken für die Messungen bei 1 bar angezeigt wird. Eine andere peristaltische Pumpe, dargestellt in Abb. S2, zeigte ebenfalls eine lineare Reaktion. Frequenzen über 20 Hz wurden nicht untersucht, da diese mit dem verwendeten Ventilblockaufbau, der eine maximale Schaltfrequenz von 20 Hz hatte, nicht erreicht werden können.

Das in Abb. 5a schematisch dargestellte Misch- und Dosiergerät enthielt zwei Einlässe, zwei Auslässe und eine On-Chip-Peristaltikpumpe. Das Misch- und Dosiergerät zeichnete sich durch das Mischen von Lebensmittelfarbe und Wasser in den Strömungskanälen des Chips aus. Während des Mischens wurden Bilder der Flüssigkeiten im Chip aufgenommen, die später mithilfe von Kalibrierungskurven in Konzentrationen umgewandelt wurden, wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ näher erläutert.

a Schematische Draufsicht auf das Gerät mit Angabe der Stelle, an der die Intensität gemessen wurde. b Bild des Kanals vor dem Mischen. Die Kanalbreite (angezeigt durch die gestrichelten Linien) beträgt 1 mm. c Bild des Kanals nach dem Mischen. Bitte beachten Sie, dass dieser Kanal abgerundet ist. Daher ist die Intensität an den Ecken geringer, während die tatsächliche Konzentration konstant ist; siehe Ergänzende Informationen S.7 für die entsprechende Kalibrierung.d Mischeffizienz im Zeitverlauf. Die Zeiten des Mischens und des anschließenden Spülens sind angegeben. Nach 17 s Mischzeit nähert sich die Mischeffizienz 90 %. e, f Berechnete Konzentration entlang der Breite des Kanals (Abstand x) vor (e) und nach (f) dem Mischen. Nach 17 s Mischzeit (n = 3) wurde eine durchschnittliche Mischeffizienz von 90,4 ± 3,32 % beobachtet. Verdünnung von 100 % Lebensmittelfarbe (Einlass B) mit Wasser (Einlass A). g Schematische Draufsicht des Geräts mit Angabe (rotes Kästchen) der Stelle, an der die Intensität gemessen wurde. h Bild der Misch- und Dosiervorrichtung zu Beginn des Experiments. i Berechnete Konzentration des Lebensmittelfarbstoffs im Kanal nach Verdünnung von 100 % Lebensmittelfarbstoff mit Wasser über 5 Zyklen. Eine exponentielle Abnahme der Lebensmittelfarbstoffkonzentration wird mit einer exponentiellen Anpassung von y = 102,69e−0,561x mit R2 = 0,999 (n = 3 Messungen) beobachtet.

Das Ausmaß der Vermischung kann als Differenz zwischen den Konzentrationsprofilen nach dem Vermischen und dem Fall der perfekten Vermischung quantifiziert werden. Wenn dies als Bruchteil der Differenz zwischen einem vollständig ungemischten Profil (einer Stufenfunktion) und demselben perfekt gemischten Fall betrachtet wird, gelangen wir zu der zuvor angegebenen Formulierung der Mischungseffizienz:40

Dabei ist N die Anzahl der Pixelzeilen, cmeasured die entlang des Kanals gemessene Konzentration, \(\bar c\) die durchschnittliche Konzentration entlang des Kanals und c0 das völlig ungemischte Konzentrationsprofil entlang des Kanals. Für dieses c0-Profil nehmen wir eine Stufenfunktion von 0 für die halbe Kanalbreite bis 2\(\bar c\) für die andere Hälfte der Kanalbreite als Referenz für den ungemischten Zustand, wie von Johnson et al.40 beschrieben .

Abbildung 5a zeigt schematisch den Ort, an dem die Intensität gemessen und die Konzentration berechnet wurde. Abbildung 5b, c zeigt die tatsächlichen Bilder vor und nach dem Mischen, wobei die berechnete Konzentration entlang der Strecke x in Abb. 5e, f dargestellt ist. Die Mischeffizienz verbesserte sich von 3,46 ± 1,61 % vor dem Mischen auf 90,4 ± 3,32 % nach 17 s Mischen. Die Mischeffizienz wurde ebenfalls über die Zeit berechnet, wie in Abb. 5d dargestellt. Eine Videoaufzeichnung des Mischvorgangs finden Sie in der Zusatzinformation S.8.

Mit dem Misch- und Dosiergerät wurde auch eine Verdünnungsreihe durchgeführt (Abb. 5g–i). Zunächst wurden die Strömungskanäle des in Abb. 5g gezeigten Geräts mit Lebensmittelfarbe gefüllt, und nachdem ein Ventil den Mischkreislauf geschlossen hatte, wurde der Hauptkanal anschließend mit 100 % Wasser gespült (Abb. 5g, h). Dieses Wasser wurde 17 Sekunden lang mit dem in der Mischschleife vorhandenen Lebensmittelfarbstoff gemischt, wodurch der Lebensmittelfarbstoff verdünnt wurde, was fünfmal wiederholt wurde, was als Verdünnungszyklen angegeben ist. Eine Videoaufzeichnung der Leistung der Verdünnungsreihe finden Sie in den Zusatzinformationen S.9. Die Konzentration im Kanal wurde mit der gleichen Methode wie für die Mischexperimente berechnet (weitere Erläuterungen in den Materialien und Methoden sowie in den Zusatzinformationen S.7). Die Konzentration im Kanal ist in Abb. 5i pro Verdünnungszyklus aufgetragen. Die Verdünnungsreihe zeigt erwartungsgemäß eine exponentielle Anpassung (R2 = 0,999), da bei jedem Zyklus etwa 37 % des gesamten Schleifenvolumens ersetzt werden.

Sowohl Scherbeanspruchung als auch die ständige Exposition gegenüber parakrinen Signalfaktoren spielen eine wichtige Rolle für die Integrität von in vitro kultiviertem Endothel. Diese beiden Faktoren können durch die Rezirkulation des Zellkulturmediums in einem Chip entweder über eine Off-Chip-Pumpe41 oder eine On-Chip-Pumpe bestehend aus Mikroventilen24,42 erreicht werden. Das vorgestellte Misch- und Dosiergerät ermöglicht die Rezirkulation des Mediums in einem geschlossenen Kreislauf. Der „Rezirkulationschip“ hat einen ähnlichen Aufbau wie der Misch- und Dosierchip (Abb. 6a), jedoch sind die Ventile 1 mm breit und der Strömungskanal ist 1 mm breit und 200 µm hoch43. Der Rezirkulationschip wird für ein Proof-of-Concept-Experiment verwendet, um Endothelzellen 96 Stunden lang unter peristaltischem Fluss zu kultivieren und dabei eine Scherspannung auf die Zellen auszuüben. Während dieser 96 Stunden wurden die Makroventile in der Peristaltikpumpe insgesamt über 3 × 106 Mal ein- und ausgeschaltet. Die peristaltische Pumpe wurde so programmiert, dass sie mit 10 Hz und einem dreiphasigen (011-101-110) Betätigungsmuster läuft, was zu einer Pumprate von 3,7 µL/min führte (Abb. 6c, gepunktete Linie). Dieses Muster wurde für die ersten Zellkultivierungsexperimente verwendet, um sicherzustellen, dass während des Pumpens ein gleichmäßiges Volumen an Medium im Kreislauf rezirkuliert, da in jedem Schritt des Pumpmusters die gleiche Anzahl geschlossener Ventile vorhanden ist. Der gleiche Chip konnte mit dem 6-Phasen-Ansteuerungsmuster auch höhere Pumpraten erzielen (Abb. 6c, durchgezogene Linie). Die Endothelzellen bildeten 96 Stunden nach der Aussaat eine konfluente Zellschicht im Strömungskanal (Abb. 6b, d).

a Schematische Draufsicht auf das Gerät mit Angaben zur peristaltischen Pumpe (rot) und der Zellkammer (grün). Die weißen Pfeile zeigen die mittlere Rezirkulationsschleife an. b Phasenkontrastmikroskopisches Bild von HUVECs (Passage Nummer 7), die 96 Stunden lang unter konstantem peristaltischem Fluss auf dem Chip kultiviert wurden. Der Maßstabsbalken entspricht 1 mm. c Gemessene Pumprate der On-Chip-Peristaltikpumpe bei verschiedenen Frequenzen mit 3-Phasen- und 6-Phasen-Betätigungsmustern (für beide n = 1). d Fluoreszenzbild der GFP-exprimierenden (grün) HUVECs mit gefärbten Zellkernen (NucBlue) und F-Aktin (rot). Der Maßstabsbalken stellt 1 mm43 dar

Unsere vorgeschlagene Herstellungsmethode (in Abb. 1d – g kurz dargestellt und im Abschnitt „Materialien und Methoden“ ausführlich beschrieben) bietet einen Ansatz für die Herstellung eines Makroventils unter Verwendung von zwei Positivformen mit nur einem Schritt der weichen Lithographie. Dieses Verfahren basiert vollständig auf Mikrofräsen, was mehrere Vorteile gegenüber dem herkömmlichen Fotolithographieverfahren mit einem Reflow-Fotolack bietet. Das Mikrofräsen gibt dem Designer große Freiheiten, da es unterschiedliche Höhen innerhalb einer Form ermöglicht, was für Fotolithographie-Master viel umständlicher wäre, da hierfür zusätzliche Masken und Herstellungsschritte erforderlich wären. Darüber hinaus ist unsere vorgeschlagene Methode völlig reinraumfrei und die mikrogefrästen Formen erfordern nach der Herstellung keine Grundierung oder Beschichtung. Die zum Mikrofräsen der beiden Formen erforderliche Zeit hängt von der Größe der Form sowie der Menge und Komplexität der Strukturen in der Form ab. Für die hier gezeigte peristaltische Pumpe und das Misch- und Dosiergerät dauerte das Mahlen beider Formen für ein Gerät 1,5 bzw. 2 Stunden. Dies ist dreimal schneller als der Herstellungsprozess der Fotolithographietechnik mit einem Reflow-Fotolack, der mindestens 6 Stunden für die Herstellung beider Wafer benötigt.

Die größeren Abmessungen unseres Makroventils ermöglichen eine größere Fehlertoleranz für die Ausrichtung der beiden Schichten als bei typischen Mikrofluidikventilen. Die Ausrichtung kann mit einem einfachen Stereomikroskop oder sogar mit bloßem Auge durchgeführt werden und erfordert keine besondere Präzision oder Erfahrung des Benutzers. Die Abmessungen (Höhe und Breite) der Kanäle und Ventile sind alle eine Größenordnung (10x) größer als diejenigen, die üblicherweise mit dem herkömmlichen Reflow-Fotolackverfahren erreicht werden.

Die vertikalen „Treppenstufen“ der abgerundeten PMMA-Struktur (Abb. 2a, b) wurden mit 10 µm gemessen und können durch einen bestimmten Parameter in der HSMworks-Software eingestellt werden (weitere Erläuterungen in den Zusatzinformationen S.1, Lösung 1A). . Eine höhere Präzision sollte möglich sein, erfordert aber mehr Rechenleistung und damit mehr Rechen- (und Fräs-)Zeit. Ein weiterer Ansatz zur Glättung der abgerundeten Struktur ist eine Behandlung mit Chloroformlösungsmittel basierend auf Ogilvie et al.39 (Ergänzende Informationen S.1, Lösung 1B). Abbildung 2 zeigt eine deutliche Glättung der PMMA-Formoberfläche aufgrund dieser Chloroform-Lösungsmittelbehandlung. Die Wirkung der Chloroform-Lösungsmittelbehandlung kann jedoch von mehreren Faktoren abhängen, wie zum Beispiel dem Volumen der verwendeten Petrischale, dem Volumen und der Konzentration des verwendeten Chloroforms und dem Abstand zwischen dem Chloroform-Flüssigkeitsspiegel und der Oberfläche der PMMA-Form. Dies führt dazu, dass die Lösungsmittelbehandlung optimiert werden muss, bevor sie verwendet werden kann, was den Herstellungsprozess verkompliziert. Wir stellten fest, dass beide zusätzlichen Glättungsoptionen nicht erforderlich waren, um den Strömungskanal vollständig zu verschließen.

Die durchgeführte systematische Charakterisierung (Abb. 3 und ergänzende Informationen S.3–S.5) stellt ein wertvolles Konstruktionswerkzeug für die Herstellung von Ventilen verschiedener Größen und/oder Anwendungen dar. Bitte beachten Sie, dass dieser Ventilverschluss stark von der Dicke der dünnen PDMS-Membran zwischen der Steuer- und Durchflussschicht abhängt. Wenn eine andere Spinngeschwindigkeit, ein anderes PDMS-Verhältnis, eine andere Formgröße oder eine andere PDMS-Viskosität verwendet wird, kann diese Dicke unterschiedlich sein, was zu Unterschieden in den Ventileigenschaften führt (siehe Zusatzinformationen S.1 Problem 2–4). Für den Verschluss abgerundeter Kanäle ab einer Breite von 500 µm empfehlen wir die Verwendung der vorgeschlagenen Fertigungstechnik, da sowohl die Steuerschicht als auch die Strömungsschicht des 250 µm-Chips sehr hohe prozentuale Abweichungen sowohl in der Breite als auch in der Höhe aufweisen (Ergänzende Informationen S. 3–S.5).

Die Ventilleckage bei Anlegen eines Drucks von 20 mbar am Strömungskanal und eines Drucks von 1,5 bar am Steuerkanal liegt im Bereich von nL/min, was nur 0,1 % der Durchflussrate bei geöffnetem Ventil und unterhalb der Nachweisgrenze beträgt (10 nL/min) des verwendeten Flusssensors. Die 90 %-Reaktionszeit von einem offenen Ventil zu einem 90 % geschlossenen Ventil betrug weniger als 0,5 s (Abb. S6). Nach diesen 0,5 s ist der Durchflusssensor nicht mehr empfindlich genug, um eine genaue Messung durchzuführen. Allerdings wird der Durchfluss außerhalb des PDMS-Chips mit einem Makroventil gemessen, was aufgrund der Trägheit der Flüssigkeit zu einer Verzögerung der Reaktionszeit führen kann. Für Kompartimentierungszwecke in OoC-Anwendungen sind diese Reaktionszeit und Ventilabdichtung ausreichend.

Abbildung 4b zeigt, dass die Pumprate mit zunehmender Betätigungsfrequenz zunimmt, bis zu einer Frequenz von 20 Hz, der maximalen Schaltfrequenz des Ventilverteilers, der die Ventile der Peristaltikpumpe steuert44. Die am häufigsten verwendete Flussrate für OoCs beträgt 0,5 µL/min18,19,25 oder 1 µL/min16,17, was mit der vorgestellten peristaltischen Pumpe leicht erreicht werden kann. Wir berichten von einer maximalen Pumprate von 48 µL/min, was viel höher ist als die Pumpraten, die für peristaltische Pumpen angegeben wurden, die mit der herkömmlichen Reflow-Fotoresist-Methode hergestellt wurden. Die von diesen Pumpen üblicherweise erreichten Pumpraten liegen zwischen 0,05 µL/min und 0,15 µL/min12,14,22,23. Pumpraten von 7,5 µL/min für Geräte mit herkömmlichen Quake-Ventilen sind dokumentiert45. Allerdings benötigen diese Pumpen sehr hohe Frequenzen (300–400 Hz), um diese Pumpraten zu erreichen, die mit dem in dieser Forschung verwendeten externen Magnetventilverteiler nicht erreicht werden können. Hochgeschwindigkeits-Elektroventile, wie sie von Goulpeau et al. verwendet werden, könnten dieses Problem lösen. Allerdings wird die erreichbare Druckschaltzeit auch durch die Betätigungsvolumina (d. h. die Volumina der Schläuche und des Steuerkanals) begrenzt45.

Abbildung 4b zeigt die nahezu vollkommen lineare Reaktion der Betätigungsfrequenz und der daraus resultierenden Pumprate. Separate Pumpen zeigen bei unterschiedlichen Frequenzen und Betätigungsdrücken leicht unterschiedliche Pumpraten, aber die oben genannte Linearität erleichtert die Kalibrierung. Abhängig von der gewünschten Durchflussrate kann die Peristaltikpumpe kalibriert werden, indem ein geeigneter Betätigungsdruck und eine geeignete Betätigungsfrequenz bestimmt werden, wie in den Zusatzinformationen S.1, Lösung 4 (Abb. S2) beschrieben. Innerhalb eines Pumpenchips erweist sich das Fluss-Frequenz-Diagramm als sehr reproduzierbar (Abb. 4b, 1 bar).

Wir haben gezeigt, dass wir die Mischeffizienz von 3,46 ± 1,61 % vor dem Mischen auf 90,4 ± 3,32 % nach 17 s Mischen verbessern konnten (Abb. 5). Im Vergleich dazu haben Kondapalli et al. zeigten ein Misch- und Dosiergerät mit der Anwendung der Rückfaltung eines Proteins auf dem Chip24, wobei sie eine erforderliche Mischzeit von 45 s zum vollständigen Mischen berichteten. Die Mischeffizienz wurde jedoch nicht quantitativ angegeben.

Eine Mischeffizienz über 90 % gilt als Hinweis auf eine gleichmäßige Verteilung entlang des Kanals46. In der Literatur handelt es sich bei mikrofluidischen Mischern jedoch um passive Mischer mit einer spezifischen Kanalstruktur, die eine Vermischung bewirkt, und die somit eine einheitliche Mischeffizienz für eine gegebene Durchflussrate aufweisen. Die Mischeffizienz in unserem System ist aus zwei Gründen schwer mit der der passiven Mischer in der Literatur zu vergleichen: Erstens wird das Mischen aktiv durch Rezirkulation erreicht, und zweitens enthält der Mischkreislauf ein Totvolumen, das während des Mischens ebenfalls rezirkuliert wird. Beide Effekte bewirken mit der Zeit eine Veränderung der Mischeffizienz. Der erste Effekt bedeutet, dass wir einfach unbegrenzt zirkulieren können, um immer bessere Wirkungsgrade zu erzielen. Der zweite Effekt bedeutet, dass es zunächst zu gewissen Schwankungen in der gemessenen Mischeffizienz kommt, wenn das Totvolumen rezirkuliert. Um dies zu überwinden und dennoch einen Vergleich mit der Literatur zu ermöglichen, haben wir stattdessen die Zeit charakterisiert, die erforderlich ist, bis die Schwingungen ausklingen, damit die Mischeffizienz 90 % erreicht. In Abb. 5d sehen wir, dass die Schwingungen nach 10 s Rezirkulation abklingen und nach 17 s eine Mischeffizienz von ~90 % erreicht wird.

Die in Abb. 5g–i dargestellte Verdünnungsreihe zeigt eine erwartete exponentielle Anpassung, da der Farbstoff in jedem Zyklus mit der gleichen Menge Wasser verdünnt wurde. Die Anpassung zeigt einen Verdünnungsfaktor von 0,561, der sich dem erwarteten Verdünnungsfaktor von 0,584 annähert, der durch Berechnung der Volumina der Kanäle im Mischkreislauf erhalten wird (Ergänzende Informationen S.10). Andere Verdünnungsfaktoren können durch Anpassung des Volumenverhältnisses im Chip erreicht werden.

Mit dem Proof-of-Concept-Zellkulturexperiment haben wir gezeigt, dass das Gerät biokompatibel ist und die Zellkultur von Endothelzellen über mehrere Tage hinweg ermöglicht. Bei den ersten Langzeitexperimenten stellten wir fest, dass die Bindung zwischen der Kontrollschicht und dem Objektträger nicht stark genug war, um einer Betätigung über mehr als 24 Stunden standzuhalten. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine zusätzliche PDMS-Schicht unter der Kontrollschicht hinzugefügt, die im Abschnitt „Materialien und Methoden“ näher beschrieben wird. In unserem ersten Zellkulturexperiment haben wir gezeigt, dass es möglich ist, die Ventile über einen Zeitraum von 96 Stunden zu betätigen, wobei wir die Ventile über 3 × 106 Mal EIN/AUS geschaltet haben.

Die peristaltische Pumpe erzeugte eine Scherspannung von etwa 0,01 Pa, wenn sie mit 10 Hz gemäß einem 3-Phasen-Muster betätigt wurde (berechnet unter Verwendung einer Näherung der Wandschubspannung in rechteckigen Kanälen47). Dies ist noch keine physiologisch relevante Scherbeanspruchung für Blutgefäße (>~0,5 Pa)48,49,50; Dieses Problem lässt sich jedoch lösen, indem man die Abmessungen der Zellkammer verringert oder das 6-Phasen-Muster verwendet, das nachweislich viel höhere Pumpraten ermöglicht. Für andere Organ-on-Chip-Anwendungen, wie zum Beispiel Darm-on-Chips, ist die erzeugte Scherspannung bereits ausreichend25.

Der vorgestellte reinraumfreie Herstellungsprozess, der auf dem Mikrofräsen einer direkten Positivform für PDMS-Makroventile im Quake-Stil basiert, ist eine Methode, die unseres Wissens bisher noch nicht beschrieben wurde. Wir zeigen, dass wir sowohl Brücken zum Überqueren als auch Ventile zum Verschließen von abgerundeten Kanälen mit einer Höhe von bis zu 700 µm und einer Breite von 1000 µm bilden können. Es wird eine systematische Charakterisierung der Ventil- und Brückenabmessungen durchgeführt, die ein wertvolles Designtool für Geräte mit Abmessungen in der Größenordnung von Hunderten von Mikrometern (250–1000 µm) darstellt, die mit der herkömmlichen Reflow-Fotolackmethode, die typischerweise zur Herstellung von Quake verwendet wird, nicht erreicht werden können -Ventile. Die Abmessungen sind speziell auf OoCs abgestimmt, und die Ergebnisse eines ersten Zellkulturexperiments stützen die Schlussfolgerung, dass Zellen mithilfe dieser Ventiltechnologie mit automatischer Mediumauffrischung für mindestens mehrere Tage kultiviert werden können. Darüber hinaus ermöglichen uns die großen Hubvolumina der Makroventile, durch peristaltisches Pumpen Pumpraten von bis zu 48 µL/min zu erreichen. Die Integration dieser Makroventile wird die Multiplexierung und automatisierte Steuerung der Zellkulturbedingungen in OoCs ermöglichen. Diese Parameter sind wichtig, um OoCs mit höherem Durchsatz zu erhalten und gleichzeitig den Bedarf an manueller Handhabung zu reduzieren.

Für jedes Design wurden zwei PMMA-Formen in 3D-CAD-Software (SolidWorks®, 2018) für die Kontroll- und Fließschichten entworfen. Die Abmessungen der hervorstehenden Strukturen hingen vom Chipdesign ab. Die Ein- und Auslässe befanden sich in einem Raster, das den Standards des ISO Workshop Agreement 23:201651 entsprach.

Zur Programmierung der Frässchritte kam HSMworks zum Einsatz, eine in SolidWorks® integrierte CAD/CAM-Software. Insbesondere waren die Toleranz- und Glättungseinstellungen im Design für die Fließschicht wesentlich, um eine glatte, abgerundete hervorstehende Struktur zu erhalten (siehe Ergänzende Informationen S.1, Lösung 1A). Das PMMA-Grundmaterial wurde mikrogemahlen (Datron Neo, Deutschland), um die Positivformen zu erhalten. Für die Fließschicht wurde eine Mühle mit 1 mm Durchmesser verwendet, und für die kleinsten Merkmale in der Kontrollschicht wurde eine Mühle mit 0,4 mm Durchmesser verwendet. Eine optionale 5-minütige Chloroform-Lösungsmittelbehandlung der PMMA-Formen nach Oglivie et al.39 kann durchgeführt werden (Ergänzende Informationen S.1, Lösung 1B). Nach dem Mikromahlen kann Staub entfernt werden, indem die Formen mit Wasser gespült werden (die Verwendung eines Ultraschallbads zur Entfernung eventueller Grate und Staub ist optional) und sie mit einer Stickstoffpistole getrocknet werden. Die PMMA-Formen benötigen keine Grundierung oder Beschichtung und können direkt zum PDMS-Guss verwendet werden.

Der in Abb. 7 dargestellte Herstellungsprozess für die PDMS-Geräte basiert auf Unger et al.12. PDMS (RTV 615, Permacol BV, Niederlande) wurde gemischt (1:7 (w/w)) für die Fließschicht und (1:20 (w/w)) für die Kontrollschicht und anschließend 1,5 Stunden lang entgast. PDMS (1:7 (w/w)) wurde auf die Form für die Fließschicht gegossen. Für die Kontrollschicht wurde PDMS (1:20 (w/w)) 60 s lang auf die mikrogefräste PMMA-Form schleuderbeschichtet, was zu einer etwa 60 µm dicken Membran an der Ventilstelle führte. Die erforderliche Spinngeschwindigkeit für diese 60 µm dicke Membran hing von der Größe der Form und der Höhe der Kontrollschicht ab. Die für die verschiedenen Chips verwendeten Drehgeschwindigkeiten sind zusammen mit anderen relevanten Parametern für das Herstellungsprotokoll in den Zusatzinformationen S.11 (Tabelle S6) zusammengefasst. Die Kontrollschicht wurde nach 20-minütigem Schleudern bei Raumtemperatur auf eine ebene Fläche gelegt, woraufhin beide Schichten 45 Minuten bei 60 °C vorgehärtet wurden. Nach dem Vorhärten wurden die Einlässe für den Strömungskanal mit einer 1-mm-Biopsiestanze (Ted Pella, Inc., USA) gestanzt. Anschließend wurden die beiden Schichten ausgerichtet und zusammengepresst, um sie zu verbinden und über Nacht bei 60 °C auszuhärten. Anschließend wurden die Einlässe für die Kontrollkanäle mit einer 0,75-mm-Biopsiestanze (Harris Uni-core) gestanzt und die Kontrollschicht mit einem Plasma auf einen Objektträger aus Glas geklebt. Die endgültigen Geräte bestanden aus drei Schichten: zwei PDMS-Schichten (Fluss und Kontrolle) und einer Glasschicht.

Schematische Darstellung der Herstellungsprozesse der PDMS-Geräte. *Bitte beachten Sie, dass die Schleudergeschwindigkeit in Schritt 3b von der Größe der PMMA-Kontrollschichtform abhängt

Bei der tagelangen Verwendung der Ventile für die Zellkultur wurde eine Delaminierung der Kontrollschicht vom Glasobjektträger beobachtet. Um dieses Problem für den Rezirkulationschip zu lösen, wurde dem Glasobjektträger eine zusätzliche PDMS-Schicht hinzugefügt. PDMS wurde gemischt (1:10 (w/w), Sylgard 184 Silikonelastomer-Kit, Dow Corning), entgast und bei 300 U/min auf einen Glasobjektträger aufgeschleudert. Diese Schicht wurde 14 Minuten lang bei 60 °C vorgehärtet, danach wurden die Kontrollschicht und der PDMS-beschichtete Glasobjektträger mit Sauerstoffplasma behandelt. Nach dem Verkleben wurde der Chip bei 60 °C vollständig ausgehärtet. Vorläufige Ergebnisse mit einer alternativen Methode, wie in den Zusatzinformationen S.1, Problem 5 beschrieben, zeigten eine vielversprechende Verbesserung der Zuverlässigkeit und Stabilität der Geräte. Diese Herstellungsmethode wird in Zukunft eingehender untersucht.

Abbildung 8a zeigt den Versuchsaufbau zur Prüfung des Schließverhaltens des Ventils. Zwei Druckregler (Fluigent, LINEUP™-Serie) wurden verwendet, um Drücke auf den Einlass und Auslass des Strömungskanals auszuüben. Die Differenz dieser Drücke ist der Differenzdruck (dP). Ein Druckregler (Fluigent, LINEUP™-Serie) wurde verwendet, um Druck auf den Steuerkanal auszuüben. In Reihe mit dem Ventil wurde ein Durchflusssensor (Fluigent, FRP Größe L) platziert.

Versuchsaufbauten zur a Prüfung des Schließverhaltens des Ventils, b Messung der von der Schlauchpumpe erzeugten Pumprate und c Messung der Mischeffizienz und Verdünnungsreihe

Zur systematischen Charakterisierung wurden die Strömungskanäle mit einem blauen Lebensmittelfarbstoff (JO-LA) gefüllt und der Ventilverschluss mithilfe eines Mikroskops mit einer Farb-CCD-Kamera (FLIR Grasshopper 3, U23S6C) zur Bildaufnahme beobachtet. Für die Ansteuerung der Steuerkanäle wurde ein maßgeschneidertes System (Convergence Industry BV, Niederlande) verwendet.

Abbildung 8b zeigt den Versuchsaufbau zur Messung der peristaltischen Pumprate. Zur Ansteuerung der drei Ventile erfolgte die Druckbeaufschlagung der Steuerkanäle über einen Ventilblock (Festo), der eine maximale Schaltfrequenz von 20 Hz aufweist und von einem Easyport-Modul (Festo) angesteuert wird. Die peristaltische Pumpe wurde 5 oder 10 Minuten lang mit einer bestimmten Frequenz und einem bestimmten Druck betätigt. Der Ausfluss wurde in Eppendorf-Röhrchen gesammelt, die vor und nach dem Pumpen gewogen wurden (Balance SX64, Mettler Toledo).

Für die Misch- und Dosiereinrichtung (Abb. 8c) wurde ein maßgeschneidertes System (Convergence) zur Ansteuerung der Steuerkanäle verwendet. Die Steuerkanäle wurden mit einem Druck von 1,5 bar betätigt. Zum Mischen wurden die drei Ventile ebenfalls mit einem 6er-Muster für 20 Zyklen bei einer Frequenz von 10 Hz angesteuert. Mit einem Druckregler (Fluigent, LINEUP™-Serie) wurde Druck auf beide Eingänge der Misch- und Dosiervorrichtung ausgeübt. Die Bilder wurden mit einer Graustufenkamera (Grasshopper3 GS3-U3-23S6M, Point Grey-Kamera) aufgenommen.

Die Bildverarbeitung und -analyse wurde mit MATLAB (2017b) durchgeführt. Zunächst wurde eine Hintergrundkorrektur durchgeführt, um allgemeine Intensitätsschwankungen zu korrigieren (Ergänzende Informationen S.7). Es wurde eine Kalibrierungssitzung durchgeführt, bei der die Durchflusskanäle des Misch- und Dosiergeräts mit bekannten Konzentrationen von in Wasser verdünntem Lebensmittelfarbstoff gefüllt wurden, um eine Kalibrierungskurve zu erhalten (Abb. S7). Abb. S7a zeigt, dass bei Füllung des Strömungskanals mit Lebensmittelfarbe die gemessene Intensität entlang der Breite des Kanals (Abstand x in Abb. 5b, c) aufgrund des abgerundeten Profils des Strömungskanals unterschiedlich ist. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Kalibrierungskurve pro Pixelzeile erstellt. Drei Kalibrierungskurven an verschiedenen Stellen entlang der Breite des Kanals sind in Abb. S7b–d dargestellt, wobei (I0/I) gegen die Konzentration aufgetragen ist. Alle Kalibrierungskurven folgten einer Polynomanpassung zweiter Ordnung. Anhand dieser Kalibrierkurven konnte die unbekannte Konzentration entlang des Kanals berechnet werden (Abb. 5). Durch die Analyse der einzelnen Bilder des Mischvorgangs wurde die Mischeffizienz über die Zeit berechnet (Abb. 5d). Pro Bild wurde die durchschnittliche Konzentration (\(\bar c\)) berechnet, die zur Berechnung der Mischeffizienz zu diesem bestimmten Bild/Zeitpunkt verwendet wurde.

Grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimierende menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) (Angio-Proteomie, USA) wurden in Endothelwachstumsmedium (EGM) (Cell Applications, Inc., CA, USA) in einem mit Kollagen I beschichteten T75 kultiviert Kolben (CELLCOAT®, Greinder Bio-One). Vor der Zellkultur wurde der Rezirkulationschip durch eine Sauerstoffplasmabehandlung (40 s, 50 Watt, Femto Science, Cute) sterilisiert und die Flusskanäle wurden mit 70 % Ethanol (Boom, Niederlande) und anschließend mit Phosphat gespült. gepufferte Kochsalzlösung (PBS, Sigma–Aldrich). GFP-exprimierende HUVECs (Passage Nummer 7) wurden in der Zellkammer mit einer Aussaatdichte von 4 × 106 Zellen/ml ausgesät. Die On-Chip-Peristaltikpumpe wurde so programmiert, dass sie ein dreiphasiges (011-101-110) Betätigungsmuster bei 10 Hz ausführt. Das Zellkulturmedium in der Schleife wurde automatisch alle 2 Stunden teilweise ausgetauscht. Die Ventile am Einlass 1 und am Auslass wurden geöffnet und die Zellkammer geschlossen (Abb. 6a), während die On-Chip-Pumpe 1 Minute lang frisches Medium in den Chip pumpte.

Das On-Chip-Kulturexperiment wurde durchgeführt, indem das Gerät 96 Stunden lang in ein speziell angefertigtes Inkubationssystem9 gestellt wurde.

Für die fluoreszenzmikroskopische Analyse wurden die HUVECs mit 4 % Paraformaldehyd (Sigma Aldrich) in PBS fixiert und anschließend mit 0,3 % Triton-X (Sigma Aldrich) in PBS permeabilisiert. Die Zellen wurden mit 15 µL/ml AcinRed (Thermo Fisher Scientific) und NucBlue (Thermo Fisher Scientific) in PBS gefärbt, um die F-Aktin-Filamente bzw. die Zellkerne sichtbar zu machen. Fluoreszenz- und Phasenkontrastbilder wurden mit einem EVOS FL-Zellbildgebungssystem aufgenommen.

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Die Autoren danken Ing. Johan Bomer für die Aufnahme der REM-Bilder und die Durchführung der Dektak-Oberflächenprofilmessungen. Dieses Projekt wurde durch ein Building Blocks of Life-Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) finanziert, Fördernr. 737.016.003 und von der Innovative Medicines Initiative 2 Joint Understanding gemäß der Finanzhilfevereinbarung Nr. 737.016.003. 853988. Dieses gemeinsame Unternehmen erhielt Unterstützung vom Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union sowie von EFPIA und JDRF International.

BIOS Lab on a Chip Group, MESA+Institute, Technisches Medizinisches Zentrum, Max-Planck-Institut für komplexe Fluiddynamik, Universität Twente, Enschede, Niederlande

Elsbeth GBM Bossink, Anke R. Vollertsen, Joshua T. Loessberg-Zahl, Loes I. Segerink & Mathieu Odijk

Gruppe „Applied Stem Cell Technologies“, Technisches Medizinisches Zentrum, Universität Twente, Enschede, Niederlande

Anke R. Vollertsen & Andries D. van der Meer

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EGBMB führte die Experimente durch, erstellte die Entwürfe und trug zur Datenanalyse und zum Verfassen von Manuskripten bei. ARV führte die Experimente durch und trug zum experimentellen Design, zum experimentellen Aufbau und zum Verfassen des Manuskripts bei. Das JTZ trug zur Datenanalyse und Nachbearbeitung sowie zum Verfassen von Manuskripten bei. ADvdM war an der Erstellung, Bearbeitung und Betreuung des Manuskripts beteiligt. LIS und MO trugen zur Datenanalyse, zum Verfassen von Manuskripten und zur Projektüberwachung bei. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Elsbeth GBM Bossink oder Mathieu Odijk.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Bossink, EGBM, Vollertsen, AR, Loessberg-Zahl, JT et al. Systematische Charakterisierung reinraumfrei gefertigter Makroventile, Demonstration von Pumpen und Mischern für die automatisierte Flüssigkeitshandhabung, abgestimmt auf Organ-on-Chip-Anwendungen. Microsyst Nanoeng 8, 54 (2022). https://doi.org/10.1038/s41378-022-00378-y

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Eingegangen: 13. Januar 2022

Angenommen: 18. März 2022

Veröffentlicht: 23. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41378-022-00378-y

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